Стамбул / Анкара …..: 1 рабочий день

Другие города ……………..: 2-3 рабочих дня

• Заказы, размещенные до 15:00, будут отправлены в тот же день.
• Заказы, сделанные после 15:00, будут отправлены на следующий день.
• Заказы будут доставлены в течение 1-3 рабочих дней, кроме государственных праздников и выходных.

Бесплатная доставка для заказов от 250 TL и выше для внутренних заказов.

Для международных заказов;

• Стоимость доставки будет рассчитана с учетом выбранного адреса доставки и будет отображаться на странице оформления заказа для международных заказов.
• Заказы будут доставлены в течение 2-5 рабочих дней после отправки заказа DHL.
• Заказы будут доставлены в течение 5-20 рабочих дней после отправки заказа с помощью PTT.
• Пожалуйста, просмотрите страницу «Часто задаваемые вопросы» для получения более подробной информации о доставке и доставке.

{{optionDefinition}}

:

{{количество}}

{{productSalesUnit}}

{{translate ‘UrunDetay_Indirimli’}} : {{{продукт.цена со скидкой}}}

{{translate ‘Global_Fiyat’}} : {{{product.productSellPrice}}}

{{translate ‘Global_KdvDahil’}} : {{{product.vatIncludedProductSellPrice}}}

{{translate ‘Global_TLFiyat’}} : {{{продукт.localSellPrice}}}

Sepet Fiyatı : {{product.cartPrice}}

TFT 11.13b для усиления Hellions, Nerf Lux и Vel’Koz: примечания к патчу

Riot подтвердила, что в патч TFT 11.13b появятся некоторые важные исправления, призванные улучшить метаданные. Были усилены геллионы, ослаблен щит заклинаний Люкс и многое другое.

Обновление среднего набора Teamfight Tactics Set 5 быстро приближается, и в преддверии масштабных изменений Riot выпустила TFT Patch 11.13, в котором были ослаблены Ясуо и Нидали, усилена черта застрельщика и многое другое.

Как всегда, они следили за изменениями, чтобы определить, есть ли какие-либо изломы, которые нужно сгладить. И действительно, было. Они определили, что Hellions нужен бафф, Spell Shield Люкс нужен нерф и многое другое. И все эти изменения будут выпущены в TFT b-patch 11.13b.

Что изменилось в TFT b-patch 11.13b?

Геллионы получат хороший бафф

Helions не показали хороших результатов с тех пор, как их несколько раз ослабляли, в том числе в TFT Patch 11.11b.

К счастью, они заслужили усиление скорости атаки. В грядущем патче их скорость атаки увеличится с 5/50/125 до 10/55/150, что кажется незначительным на бумаге, но должно хорошо отображаться в игре.

Отдельные Геллионы Клед, Поппи и Кеннен также получат полезные баффы.

Спелл-щит Люкс ослаблен

Люкс был одним из лучших юнитов с тремя ценами в Наборе 5. Итак, чтобы держать ее под контролем, Riot решили сделать ее щит заклинаний менее эффективным, сделав его менее эффективным. Если говорить о цифрах, то она уменьшена с 125/200/400 до 120/180/360.

В качестве компенсации они немного увеличили ее запас маны с 40/70 до 40/80, но это почти не компенсирует ослабление.

Помимо индивидуального нерфа Люкс, Redeemed — основа мета-композиции Vel’Koz, а также керри Lux — был уменьшен до шести и девяти единиц.

Стивен «Мортдог» Мортимер подтвердил, что патч 11.13b для TFT выйдет 30 июня.

Если вы хотите ознакомиться со всеми изменениями, вы можете найти их все в полном списке примечаний к патчу.

TFT patch 11.13b примечания

Чемпионов

1-стоимость

Клед

• Урон от атаки увеличен с 60 до 65

Мак

• Мана увеличена с 30/70 до 50/70

2-стоимость

Кеннен

• Скорость атаки увеличена с 0.65 до 0,7

3-стоимость

Люкс

• Мана увеличена с 40/70 до 40/80
• Spell Shield снижен с 125/200/400 до 120/180/360

Черты

Геллион

• Скорость атаки увеличена с 5/50/125% до 10/55/150%

Погашено

• AP / Armor / MR уменьшено с 30/60/100 до 30/55/95
.

Границы | Требования LaeA, VeA и VelB к бесполому развитию, биосинтезу охратоксина А и вирулентности грибов у Aspergillus ochraceus

Введение

Охратоксин А (ОТА) является вторичным метаболитом видов Aspergillus и Penicillium (Wang et al., 2016а, б). Это представляет серьезную опасность для здоровья из-за его микотоксических свойств (Taniwaki et al., 2018). Он классифицируется как возможный канцероген для человека (группа 2B) Международным агентством по изучению рака (IARC, 1993). ОТА впервые был выделен из A. ochraceus в 1965 г. (van der Merwe et al., 1965). Сообщается, что он является основным источником ОТА в зерновых, Zea mays , кофе, фруктах и ​​напитках (Mantle, 2002).

Биосинтетический путь OTA широко изучался в последние десятилетия (William and Hamilton, 1979; Wang et al., 2015; Галло и др., 2017; Geisen et al., 2018). Ван идентифицировал консервативный кластер биосинтетических генов OTA сравнительным анализом шести грибов, продуцирующих OTA, и выяснил его биосинтетический путь с помощью делеционных мутантов четырех структурных генов ( otaA , B , C и D ) и одного регуляторный ген ( otaR1 ) (Wang et al., 2018a, b). Факторы окружающей среды имеют решающее значение для регулирования производства ОТА (Selouane et al., 2009; Abarca et al., 2019).Механизм биосинтеза ОТА очень сложен и действует на разных уровнях. Как правило, сигналы окружающей среды передаются в биосинтетический кластер, чтобы активировать / подавить продукцию OTA глобальными регуляторами и мультибелковыми комплексами. Напр., Aoyap1 , фактор транскрипции, связанный с окислительным стрессом, регулирует синтез OTA, контролируя окислительно-восстановительный баланс клеток у A. ochraceus (Reverberi et al., 2012). Факторы транскрипции AopacC (Wang et al., 2018a, b) и hog (Schmidt-Heydt et al., 2012), которые функционально осуществляются посредством передачи сигналов pH и осмотического стресса, также участвуют в регуляторном механизме биосинтеза OTA при стрессе pH и осмотическом стрессе, соответственно. Гетеротримерный бархатный комплекс VelB / VeA / LaeA наиболее изучен на грибах для выяснения связи между светозависимой морфологией и вторичным метаболизмом. В A. nidulans , VeA связывает VelB с LaeA, главным ядерным регулятором вторичного метаболизма (Bayram et al., 2008). LaeA также был предложен в качестве эпигенетического регулятора его функций метилтрансферазы в отношении аминокислот лизина и аргинина.Несколько структур гомологичных белков LaeA были идентифицированы у A. fumigatus (Bok et al., 2005), A. oryzae (Oda et al., 2011), Cochliobolus heterostrophus (Wu et al., 2012), Fusarium oxysporum (Lopez-Berges et al., 2014), P. chrysogenum (Veiga et al., 2012) и Trichoderma reesei (Karimi-Aghcheh et al., 2013) и продемонстрировали сильное влияние на споруляцию. емкость, рост мицелия, образование склероций и выработка вторичных метаболитов.

Было проведено несколько исследований по регулированию биосинтеза микотоксинов с помощью LaeA. Делеция laeA в A. flavus привела к потере афлатоксина, опосредованной потерей экспрессии aflR , специфического фактора транскрипции в биосинтетическом кластере афлатоксина. Продукция конидий, образование склероций и колонизация хозяином подавлялись в ΔlaeA A. flavus (Kale et al., 2008). Удаление laeA и veA значительно снижает споруляцию и сильно снижает выработку монометилового эфира альтернариола и альтернариола (Estiarte et al., 2016). В A. carbonarius Crespo-Sempere предположил, что VeA и LaeA играют важную роль в регуляции конидиации и биосинтеза OTA (Crespo-Sempere et al., 2013). Было доказано, что ген veA действует как положительный регулятор продукции конидий, биосинтеза ОТА и устойчивости к окислительному стрессу у A. niger (Zhang et al., 2018). A. steynii , A. niger , P. nordicum и P. verrucosum были описаны в отношении их способности вызывать OTA-ответ на свет (Schmidt-Heydt et al., 2010, 2011). Однако необходимо всестороннее изучение биосинтеза ОТА, регулируемого бархатным комплексом, в ответ на свет.

До сих пор имеется ограниченная информация о связи света и биосинтеза ОТА и их регуляторном механизме у A. ochraceus , за исключением того, что Азиз сообщил, что белый и ультрафиолетовый свет повлияли на рост мицелия и продукцию ОТА в 1997 году (Aziz and Moussa, 1997). О функции белков бархатного комплекса у A. ochraceus ничего не сообщалось.С этой целью мы идентифицировали и удалили члены комплекса velvet (laeA, veA и velB) в A. ochraceus и исследовали их регулирующую роль в морфологии роста, биосинтезе OTA и вирулентности грибов на грушах. Кроме того, мы продемонстрировали, как LaeA влияет на вторичный метаболизм A. ochraceus на уровне экспрессии генов.

Материалы и методы

Штаммы и условия роста

Штамм A. ochraceus fc-1 дикого типа (WT), использованный в данном исследовании, был выделен, охарактеризован и секвенирован в нашей лаборатории (Wang et al., 2018а, б). Штаммы дикого типа и мутантные штаммы обычно культивировали при 28 ° C в темноте. Для исследований фенотипа и экспрессии генов все использованные штаммы культивировали на картофельном агаре с декстрозой (PDA, BD DifcoTM, США) при 28 ° C. Каждый штамм культивировали на четырех чашках в качестве технических повторностей, и каждый эксперимент повторяли три раза в биологических повторностях.

Филогенетическое дерево и функциональный анализ

аминокислотных последовательностей LaeA, VeA и VelB из A. nidulans (Bayram et al., 2008), A. flavus (Kale et al., 2008) и Cochliobolus heterostrophus (Wu et al., 2012) использовались в качестве запросов, а базовый алгоритм инструмента поиска локального выравнивания использовался для поиска LaeA, VeA, и VelB из генома A. ochraceus , A. niger , A. welwitschiae , A. lacticoffeatus , A. sclerotioniger , A. steynii и P. nordicum из Национальный центр биотехнологических информационных ресурсов (NCBI).Аминокислотные последовательности LaeA были выровнены с помощью MUSCLE, а филогения максимального правдоподобия была построена с помощью treeBeST с использованием 1000 повторений начальной загрузки.

Поколение мутантов, делающих гены

Для конструирования мутантов laeA , veA и velB использовался предыдущий подход, описанный в нашей группе, и кассеты делеции были созданы с помощью процедур ПЦР с перекрытием (Wang et al., 2018a, b). Праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S1.Затем продукты гибридной ПЦР трансформировали в протопласты A. ochraceus . Трансформанты проверяли саузерн-блоттингом. Вкратце, приблизительно 20 мкг геномной ДНК каждого образца были полностью переварены, отделен 1% агарозным гелем и перенесен на нейлоновую мембрану Hybond-N + (GE healthcare, UK). После денатурации щелочью и нейтрализации гибридизацию выявляли с помощью зондов, меченных дигоксигенином, с использованием стартового набора II для мечения и обнаружения ДНК DIG (Roche, Базель, Швейцария) в соответствии с инструкциями производителя.Праймеры для амплификации зонда перечислены в дополнительной таблице S1.

Фенотипические исследования мутантов

Для оценки роста мутанта планшеты с PDA инокулировали в центре 1 мкл суспензии конидий (10 ⁶ конидий / мл) каждого штамма, и культуры инкубировали при 28 ° C в течение 9 дней в двух условиях, белый свет (Mazda, 23 Вт CFT / 827, 1485 лм) и темноте. Скорость роста анализировали путем измерения диаметра колонии каждого мутанта. Для фенотипического исследования гифы и споры наблюдали под оптическим микроскопом и электронным микроскопом.Для дальнейшего анализа конидии собирали с шести пробок агара (диаметром 1 см) из эквивалентных зон грибковой поверхности КПК. Собранные образцы гомогенизировали и разбавляли 0,1% твином-80 и подсчитывали с помощью гемоцитометра.

Анализ продукции охратоксина А

Для исследования OTA, WT, ΔlaeA, ΔveA и ΔvelB A. ochraceus культивировали на КПК в течение 9 дней в условиях света и темноты. Шесть пробок агара (диаметром 1 см) из эквивалентных зон грибковой поверхности PDA собирали и экстрагировали 6 мл метанола ультразвуком.Затем супернатант фильтровали через фильтр 0,22 мкм во флакон. Затем был проведен анализ ВЭЖХ на системе ВЭЖХ Agilent для анализа концентрации ОТА, как описано ранее (Wang et al., 2018a, b).

Анализ патогенности

Свежие груши ( Pyrus × bretschneideri ) были отобраны для тестирования патогенности WT и мутантных штаммов A. ochraceus in vitro . Верхнюю поверхность груш дезинфицировали трижды 0,1% гипохлоритом натрия (NaClO) в течение 10 с и ополаскивали стерильной водой в течение 30 с.Каждую грушу прокалывали стерильной иглой на глубину примерно 2 мм, чтобы сделать рану (диаметр 2 мм) для инокуляции, вводили 2 мкл суспензии конидий (10 ⁶ конидий / мл) в рану, в отличие от стерилизованной воды, служившей контролем и инкубировали при 28 ° C в темноте. Диаметр струпа измеряли через 5 и 9 дней.

Выделение ДНК и РНК

Мицелий штаммов A. ochraceus собирали путем фильтрации . Геномную ДНК выделяли с помощью набора Qiagen DNeasy в соответствии с протоколом производителя.Для выделения РНК ткани мицелия A. ochraceus выращивали на среде PDA при 28 ° C в течение 9 дней в условиях освещения. РНК экстрагировали с помощью реагента ТРИЗОЛ (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом производителя.

Анализ полимеразной цепной реакции в реальном времени и количественный анализ полимеразной цепной реакции в реальном времени

Три биологических повтора были выполнены для каждого анализа относительных уровней экспрессии. Обратную транскрипцию 500 нг РНК проводили с помощью набора TIANScript II RT Kit (TIANGEN, Китай).Ген A. ochraceus gadph служил внутренним стандартом. Праймеры для амплификации RT-PCR перечислены в дополнительной таблице S2. КДНК анализировали с помощью qRT-PCR с использованием SYBR Premix Ex Taq ^™ II (TAKARA) на BIO-RAD CFX96 (BIO-RAD). Для нормализации использовали ген gadph , служащий геном домашнего хозяйства. Значения относительной экспрессии были рассчитаны, а отношения экспрессии были определены количественно с использованием метода 2 ^-∆∆Ct . Праймеры перечислены в дополнительной таблице S3.

Статистический анализ

Все данные были проанализированы с помощью IBM SPSS statistics версии 20 и представлены со средними значениями и стандартным отклонением. Статистическая значимость между группами образцов рассчитывалась с помощью дисперсионного анализа, а средние значения сравнивались по наименьшей значимой разнице (LSD) и критерию Дункана. Разница считалась статистически значимой при p <0,05.

Результаты

Идентификация, анализ и разрушение LaeA, VeA и VelB в

Чтобы идентифицировать гомологи белка бархата в A. ochraceus , последовательность генома A. ochraceus была исследована с использованием подхода Blast-выравнивания. Поиски BlastP проводили с использованием аминокислотных последовательностей LaeA, VeA и VelB из A. nidulans , A. flavus и Cochliobolus heterostrophus в качестве зондов, и были идентифицированы гомологи AoFC_03061, AoFC_07220 и AoFC_09406. LaeA из A. steynii (XP_024703593.1), VeA из A. tanneri (THC96327.1) и VelB из A. tanneri (THC97134.1) оказались наиболее родственны белкам комплекса бархатных в A. ochraceus , с идентичностью 95,2, 72,5 и 89,6% соответственно. Было построено филогенетическое дерево эволюционных взаимоотношений белков LaeA от различных видов, включая OTA-продуцирующие грибы (Рисунок 1), показывающее, что LaeA сохранялась среди видов Aspergillus . Инактивация локусов LaeA, VeA и VelB была получена путем гомологичной замены генов кодирующим геном фосфотрансферазы гигромицин B ( hygR ).Стратегия создания мутантов показана на дополнительном рисунке S1A. Изолят, устойчивый к гигромицину B, подвергали скринингу с помощью ПЦР с использованием праймеров в маркерном гене, а именно hygR , и вне кассеты для нокаута (дополнительная фигура S1B). По крайней мере, три трансформанта каждого мутанта с разрушенным геном были получены из поколения мутантов. Саузерн-блот-анализ также показал, что ΔlaeA (фиг. 2A), ΔveA (фиг. 2B) и ΔvelB (фиг. 2C) не имеют генов-мишеней ( laeA, veA и velB ).

Рисунок 1 . Филогенетическая взаимосвязь белка LaeA разных видов. Грибы, продуцирующие ОТА, были отмечены красным цветом.

Рисунок 2 . Подтверждение делеции генов laeA, veA и velB с помощью саузерн-блоттинга. (A) Изоляты WT и ΔlaeA гидролизовали EcoR I. В качестве зонда использовали фрагмент, амплифицированный из ΔlaeA. (B) Изоляты WT и ΔveA расщепляли EcoR I. В качестве зонда использовали фрагмент, амплифицированный из ΔveA. (C) Изоляты WT и ΔvelB расщепляли BamH I. В качестве зонда использовали фрагмент, амплифицированный из ΔvelB.

Вовлечение LaeA, VeA и VelB в бесполое развитие, скорость роста и конидиацию

Ряд различий, связанных с морфологией колоний, бесполым развитием и конидиацией, наблюдали в ΔlaeA, ΔveA и ΔvelB по сравнению с WT A. ochraceus на среде PDA в светлых и темных условиях. В условиях освещения, как показано на фиг. 3A, колонии WT росли в виде желтого однородного слоя, в то время как мутант с делецией laeA рос в виде бело-желтого покрова.Мы также наблюдали уменьшение пигмента для ΔlaeA и увеличение пигмента для ΔveA и ΔvelB в задней части чашек Петри. В темноте WT A. ochraceus показал большую пигментацию по сравнению с светом. ΔlaeA вырос до белого цвета из-за уменьшения количества спор и пигмента (рис. 3А). Снижение конидиофора в ΔlaeA по сравнению с другими штаммами от края колонии в темноте наблюдалось на сканирующей электронной микрофотографии (рис. 3В).

Рисунок 3 .Вид колонии штаммов WT, ΔlaeA, ΔveA и ΔvelB A. ochraceus . (A) Передняя и задняя часть колонии A. ochraceus в светлых и темных условиях. (B) Сканирующая электронная микрофотография штаммов A. ochraceus (масштабная линейка = 200 мкм). Красным квадратом обозначена часть колонии для наблюдения.

Условия освещения не влияли на скорость роста штаммов A. ochraceus для WT и ΔlaeA, подавляя при этом рост ΔveA и ΔvelB ( p <0.05). Скорость роста была значительно снижена в ΔlaeA, ΔveA и ΔvelB по сравнению с WT (рис. 4A). Грибки, продуцирующие микотоксины, вызывали обширные инвазии, вызывая бесполые споры, называемые конидиаспорами. Чтобы исследовать участие LaeA, VeA и VelB в конидиации, подсчитывали число конидиаспор для штаммов, культивированных в течение 9 дней в условиях света и темноты. Мы обнаружили, что генерация конидий увеличивалась в световых условиях для штаммов A. ochraceus , хотя количество конидиаспор ΔvelB в светлых и темных условиях демонстрировало незначительную разницу на статистическом уровне (Рисунок 4B).Делеция laeA привела к резкому снижению образования конидий, инактивация которых привела к A. ochraceus , почти потерявшему способность генерировать конидиаспоры в темноте (рис. 4B). Количество конидиафоров ΔlaeA и ΔvelB в условиях освещения продемонстрировало значительную разницу по сравнению с WT. Эти результаты показали, что белки бархатного комплекса (LaeA, VeA и VelB) играют важную роль в фенотипе колонии, скорости роста и конидиации.

Рисунок 4 .Влияние делеции LaeA, VeA и VelB на рост колоний и конидиацию A. ochraceus . (A) Диаметр WT, ΔlaeA, ΔveA и ΔvelB в условиях света и темноты. (B) Производство конидиаспор WT, ΔlaeA, ΔveA и ΔvelB в условиях света и темноты. Различные буквы указывают на значительную разницу между соответствующими значениями ( p <0,05) с тремя биологическими повторностями.

Потребность в LaeA, VeA и VelB в биосинтезе охратоксина А

Чтобы выяснить, связаны ли LaeA, VeA или VelB со вторичным метаболизмом, связанным с биосинтезом ОТА, были произведены неочищенные экстракты A.ochraceus из 9-дневных культур анализировали с помощью ВЭЖХ. Результаты показали, что делеция laeA , veA и velB резко снижает продукцию OTA. WT A. ochraceus продуцировал около 1 и 7 мкг / см ² OTA в светлых и темных условиях на среде, в то время как три мутанта с делецией гена продуцировали менее 20 нг / см ² OTA (фиг. 5A). Мы наблюдали, что белый свет был фактором ингибирования биосинтеза ОТА. Для дальнейшего выяснения функции LaeA как регулятора биосинтеза OTA, уровень экспрессии генов в кластере биосинтеза OTA был сравнительно исследован у WT и ΔlaeA в темноте.Как показано на рисунке 5B, результаты анализа qRT-PCR подтвердили, что уровень экспрессии otaA , otaB , otaC , otaR1 и otaD снижался в 2-40 раз в ΔlaeA по сравнению с таковыми. гены в WT. Вышестоящий ген AoFC_09697 и нижележащий ген AoFC_09703 показали разные профили экспрессии в WT, а также ΔlaeA по отношению к биосинтетическому гену ОТА. Транскрипты четырех биосинтетических генов OTA ( otaA , otaB , otaD и otaR1 ) были обнаружены в WT путем амплификации с помощью RT-PCR, но не в ΔlaeA.Ген otaC не был обнаружен у WT из-за его низкого уровня экспрессии (рис. 5C). Эти результаты соответствовали продукции OTA, которая могла быть обнаружена у WT и не могла быть обнаружена в ΔlaeA.

Рисунок 5 . Продукция ОТА в WT, ΔlaeA, ΔveA и ΔvelB у A. ochraceus . (A) Концентрация ОТА в WT, ΔlaeA, ΔveA и ΔvelB в условиях света и темноты. Разные буквы указывают на значительную разницу между соответствующими значениями ( p <0.05) с тремя биологическими повторами. (B) qRT-PCR выполняли для проверки соотношения экспрессии генов, которые участвуют в биосинтезе OTA, а также присутствуют внутри и вне кластера биосинтетических генов OTA у WT, и сравнивали с мутантом ΔlaeA. (C) RT-PCR-амплификация генов в кластере биосинтетических генов OTA и вне его.

Роль LaeA, VeA и VelB в вирулентности грибов

Установлено влияние LaeA, VeA и VelB на способность A. ochraceus заражать груши.Диаметр поражения измеряли через 5 и 9 дней после заражения. После инкубации в течение 5 дней наблюдали поражения, инфицированные всеми штаммами A. ochraceus . Очевидно, поражения, инфицированные ΔlaeA, ΔveA и ΔvelB, были репрессированы по сравнению с поражениями, инфицированными WT (фиг. 6A). Рисунок 6B продемонстрировал значительную разницу в уровне статистики. После инкубации в течение 9 дней поражение, инфицированное WT, явно увеличивалось. Поражения, инфицированные ΔveA и ΔvelB, мало изменились по сравнению с инкубацией в течение 5 дней.Это исследование показало, что потеря белков бархата ослабит способность инфицирования A. ochraceus груши.

Рисунок 6 . Анализ патогенности для WT и мутантов A. ochraceus на грушах. (A) Груши, инфицированные WT, ΔlaeA, ΔveA и ΔvelB, инкубировали при 28 ° C в течение 5 и 9 дней в темноте и фотографировали. (B) Диаметр парши груш, измеренный перекрестным методом. Разные буквы указывают на значительную разницу между соответствующими значениями ( p <0.05) с тремя биологическими повторами.

LaeA широко регулируемый вторичный метаболизм у

Как сообщалось ранее, геном A. ochraceus содержит 99 кластеров генов биосинтеза вторичных метаболитов (Wang et al., 2018a, b). Уровень экспрессии основных генов в кластере вторичных метаболитов проверяли с помощью qRT-PCR (рис. 7). Около 66,1% генов скелета в кластере дифференциально экспрессировались при p <0.01, и 81,6% генов дифференциальной экспрессии подавлялись в мутанте с делецией laeA . Примерно 58,6% уровня экспрессии основных генов регулировались по крайней мере в два раза, из которых 81,2% были подавлены. Эти результаты показали, что LaeA важен для экспрессии значительной части генов, кодирующих вторичный метаболит.

Рисунок 7 . LaeA влиял на уровень экспрессии генов биосинтеза вторичных метаболитов. И WT, и ΔlaeA имели три биологических повтора.Оси Y представляют собой гены скелета в PKS, NRPS, Terpene, Hybrid и других кластерах генов. Оси X представляют собой соотношение экспрессии генов, экспрессируемых в WT, по сравнению с генами, экспрессируемыми в ΔlaeA.

Обсуждение

Загрязнение ОТА продуктов питания, кормов и фруктов является серьезной проблемой для здоровья во всем мире. A. ochraceus является основным продуцентом OTA с широким диапазоном хозяев. Кроме того, ряд вторичных метаболитов, таких как циркумдатин G и H (Dai et al., 2001; Lopez-Gresa et al., 2005), стефацидин A и B (Jingfang Qian-Cutrone et al., 2002), Speramides A и B (Chang et al., 2016) и васпергилламид B (Frank et al., 2019) могли производиться с помощью A. ochraceus и исследователи никогда не отказываются от выделения новых соединений из этого грибка. Однако роль вторичных метаболитов, за исключением охратоксинов, на здоровье и вирулентность неизвестна. И мало что известно о генетической регуляции множества вторичных метаболитов, включая процесс биосинтеза OTA. Таким образом, глубокое изучение регуляторных генов, участвующих в метаболических путях, может обеспечить лучшее понимание механизма регуляции вторичных метаболитов.

В 2008 году было обнаружено, что LaeA и два семейства бархатных, VeA и VelB, подтвердили триметирный комплекс, который важен для координации вторичного метаболизма и развития A. nidulans в темноте (Bayram et al., 2008). VeA образует светочувствительный мост, который связывает VelB и LaeA. Три белка были консервативными у разных грибов. В WT A. ochraceus свет вызывает увеличение конидиоспор на 50% и уменьшение OTA на 92%. Установлено, что биосинтез ОТА снижался в условиях освещения для других охратоксингенных грибов, таких как A.carbonarius , A. niger , P. verrucosum и P. nordicum (Schmidt-Heydt et al., 2010; Crespo-Sempere et al., 2013), показали, что развитие и вторичный метаболизм регулируется состоянием света и может быть объяснено ролью комплекса бархата. Здесь мы впервые сообщаем о функции LaeA, VeA и VelB в A. ochraceus , а также предоставляем представление о механизме светорегулирования биосинтеза OTA.

Таким образом, мы получаем делеционные мутанты laeA , veA и velB из A.ochraceus и сравнить их характеристики развития, биосинтеза ОТА и вирулентности грибов на грушах. Делеция laeA приводила к резкому сокращению конидиаспор, а делеция laeA, VeA и VelB приводила к замедлению скорости роста. Биосинтез OTA строго регулируется LaeA, VeA и VelB, поскольку продукция OTA снижается на три порядка у делеционных мутантов. Все три белка повлияли на патогенность A. ochraceus на грушах.Однако мы не смогли подтвердить, связана ли патогенность с биосинтезом ОТА. Сообщалось, что некоторые исследования доказывают роль микотоксина в вирулентности грибов (Barad et al., 2014), тогда как другие нет (Ballester et al., 2015). Для изучения стратегий загрязнения OTA имеет смысл углубленное изучение взаимосвязи между развитием, биосинтезом OTA и вирулентностью грибов A. ochraceus .

Механизм LaeA, играющий свою регуляторную роль, до сих пор неясен, хотя ряд исследований, относящихся к различным грибам, сосредоточен на LaeA.Принадлежность к бархатному комплексу — лишь один из механизмов. Сайт связывания S-аденозилметионина, содержащийся в LaeA, предположительно указывает на его метилтрансферазную активность. Кроме того, было высказано предположение, что этот белок был связан с изменениями в структуре хроматина, потому что потеря LaeA приводит к увеличению меток гетерохроматина и часто точной регуляции вторичных метаболитов (Bok and Keller, 2016). В этом исследовании мы сосредоточились на регуляторной роли LaeA в генах биосинтеза вторичных метаболитов для его широко признанной функции.Около 66,7% генов основной цепи в кластере NRPS в значительной степени регулируются LaeA, среди которых около 85,7% генов подавлены. Помимо основных генов в PKS, Terperne, гибридных и других кластерах, 66,1% генов значительно регулировались, а 81,6% генов дифференциальной экспрессии подавлялись (рис. 7). Эти данные доказали роль LaeA в регуляции биосинтеза вторичных метаболитов, а делеция laeA подавляла экспрессию многих соединений, как сообщалось ранее (Bok and Keller, 2004; Perrin et al., 2007). Хотя структура соединений, соответствующих каждому кластеру, не была ясна, это исследование позволит получить представление о связи между соединениями и кластерами биосинтетических генов.

В заключение, результаты этого исследования предоставили некоторые доказательства того, что белки бархатного комплекса (LaeA, VeA и VelB) играют важную роль в развитии морфологии, биосинтезе OTA и вирулентности грибов у A. ochraceus . Кроме того, мы продемонстрировали, что LaeA широко влияет на экспрессию гена A.ochraceus с акцентом на вторичные метаболиты. Эффект понижающей регуляции LaeA был больше, чем эффект повышающей регуляции вторичного метаболизма. Учитывая сильное влияние laeA , veA и velB на биосинтез ОТА, эти гены могут быть сконструированы как сайты-мишени для разработки новых стратегий контроля и предотвращения ОТА.

Заявление о доступности данных

Все наборы данных, созданные для этого исследования, включены в статью / дополнительные материалы.

Авторские взносы

YL и GW разработали эксперимент. GW, YW, FL, EL, JM, BY и CZ проводили эксперименты. GW, LL и HZ проанализировали данные. GW написал рукопись.

Финансирование

Исследование было поддержано Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (№ 2017YFC1600903), Пекинским фондом естественных наук (№ 61

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.02759/full#supplementary-material

Список литературы

Абарка М. Л., Брагулат М. Р., Кастелла Г. и Кабанес Ф. Дж. (2019). Влияние некоторых факторов окружающей среды на рост и продукцию охратоксина а Aspergillus niger и Aspergillus welwitschiae . Внутр. J. Food Microbiol. 291, 10–16. DOI: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2018.11.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Азиз, Н. Х., и Мусса, Л. А. (1997). Влияние белого света, ближнего УФ-излучения и других условий окружающей среды на продукцию афлатоксина B1 Aspergillus flavus и охратоксина a Aspergillus ochraceus . Нарунг 41, 150–154. DOI: 10.1002 / food.19970410307

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баллестер, А.Р., Марсет-Хубен, М., Левин, Э., Села, Н., Сельма-Лазаро, К., Кармона, Л. и др. (2015). Геном, транскриптом и функциональный анализ Penicillium expansum позволяют по-новому взглянуть на вторичный метаболизм и патогенность. Мол. Взаимодействие с растительными микробами. 28, 232–248. DOI: 10.1094 / MPMI-09-14-0261-FI

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барад С., Горовиц С. Б., Кобилер И., Шерман А. и Пруски Д. (2014). Накопление микотоксина патулина в присутствии глюконовой кислоты способствует патогенности Penicillium expansum . Мол. Взаимодействие с растительными микробами. 27, 66–77. DOI: 10.1094 / MPMI-05-13-0138-R

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Байрам, О., Краппманн, С., Ни, М., Бок, Дж. У., Хельмштадт, К., Валериус, О., и др. (2008). Комплекс VelB / VeA / LaeA координирует световой сигнал с развитием грибков и вторичным метаболизмом. Наука 320, 1504–1506. DOI: 10.1126 / science.1155888

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бок, Дж. У., Balajee, S.A., Marr, K.A., Andes, D., Nielsen, K.F., Frisvad, J.C., et al. (2005). LaeA — регулятор факторов морфогенетической вирулентности грибов. Эукариот. Cell 4, 1574–1582. DOI: 10.1128 / EC.4.9.1574-1582.2005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бок, Дж. У., и Келлер, Н. П. (2016). «Понимание вторичного метаболизма грибов на основе десятилетних исследований LaeA» в Биохимия и молекулярная биология (микота) . изд. Д. Хоффмайстер (Springer International Publishing Switzerland: Springer Press).

Google Scholar

Chang, Y.-W., Yuan, C.-M., Zhang, J., Liu, S., Cao, P., Hua, H.-M., et al. (2016). Сперамиды A – B, два новых пренилированных индольных алкалоида из пресноводного гриба Aspergillus ochraceus KM007. Tetrahedron Lett. 57, 4952–4955. DOI: 10.1016 / j.tetlet.2016.09.071

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Креспо-Семпере, А., Марин, С., Санчис, В., и Рамос, А. Дж. (2013). Факторы транскрипции VeA и LaeA регулируют биосинтез охратоксина а у Aspergillus carbonarius . Внутр. J. Food Microbiol. 166, 479–486. DOI: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2013.07.027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дай, Дж., Карт, Б. К., Сайдботтом, П. Дж., Сек Ю, А. Л., Нг, С., Хуанг, Ю. и др. (2001). Циркумдатин G, новый алкалоид гриба Aspergillus ochraceus . J. Nat. Prod. 64, 125–126. DOI: 10.1021 / np000381u

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эстиарт, Н., Лоуренс, К. Б., Санчис, В., Рамос, А. Дж., И Креспо-Семпере, А. (2016). LaeA и VeA участвуют в морфологии роста, бесполом развитии и продукции микотоксинов у Alternaria alternata . Внутр. J. Food Microbiol. 238, 153–164. DOI: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2016.09.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Франк М., Озкая Ф., Мюллер В., Хамахер А., Кассак М., Лин В. и др. (2019). Скрытые вторичные метаболиты губчатого гриба Aspergillus ochraceus . мар. Наркотики 17:99. DOI: 10.3390 / md17020099

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Галло А., Феррара М. и Перроне Г. (2017). Последние достижения в молекулярных аспектах биосинтеза охратоксина. Curr. Opin. Food Sci. 17, 49–56. DOI: 10.1016 / j.cofs.2017.09.011

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гейзен, Р., Шмидт-Хейдт, М., Тухами, Н., и Химмельсбах, А. (2018). Новые аспекты биосинтеза охратоксина А и цитринина в Penicillium . Curr. Opin. Food Sci. 23, 23–31. DOI: 10.1016 / j.cofs.2018.04.001

CrossRef Полный текст | Google Scholar

МАИР (1993). Некоторые вещества природного происхождения: пищевые продукты и их компоненты, гетероциклические ароматические амины и микотоксины. IARC Monogr. Eval. Канцерогенный. Риски Hum. 56, 489–521.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Jingfang Qian-Cutrone, S.H., Shu, Y.-Z., Vyas, D., Fairchild, C., Menendez, A., Krampitz, K., et al. (2002).Стефацидин A и B: два структурно новых, селективных ингибитора тестостерон-зависимых клеток LNCaP простаты. J. Am. Chem. Soc. 124, 14556–14557. DOI: 10.1021 / ja028538n

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кале, С. П., Милде, Л., Трапп, М. К., Фрисвад, Дж. К., Келлер, Н. П., и Бок, Дж. У. (2008). Потребность LaeA для вторичного метаболизма и склерообразования у Aspergillus flavus . Fungal Genet. Биол. 45, 1422–1429. DOI: 10.1016 / j.fgb.2008.06.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карими-Агчех Р., Бок Дж. У., Фатале П. А., Смит К. М., Бейкер С. Е., Личиус А. и др. (2013). Функциональный анализ Trichoderma reesei LAE1 выявляет консервативные и противоположные роли этого регулятора. G3 3, 369–378. DOI: 10.1534 / g3.112.005140

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лопес-Бергес, М.С., Шафер, К., Гера, К., и Ди Пьетро, ​​А. (2014). Комбинаторная функция бархата и AreA в транскрипционной регуляции утилизации нитратов и вторичного метаболизма. Fungal Genet. Биол. 62, 78–84. DOI: 10.1016 / j.fgb.2013.11.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лопес-Греза, М. П., Гонсалес, М. К., Примо, Дж., Мойя, П., Ромеро, В., и Эсторнелл, Э. (2005). Циркумдатин H, новый ингибитор митохондриальной НАДН-оксидазы, из Aspergillus ochraceus . J. Antibiot. 58, 416–419. DOI: 10.1038 / ja.2005.54

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мантия, П. Г. (2002). Оценка риска и важность охратоксинов. Внутр. Биодетериор. Биоразложение 50, 143–146. DOI: 10.1016 / S0964-8305 (02) 00079-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ода К., Кобаяши А., Охаши С. и Сано М. (2011). Aspergillus oryzae laeA регулирует гены синтеза койевой кислоты. Biosci. Biotechnol. Biochem. 95, 1832–1834. DOI: 10.1271 / bbb.110235

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Перрин, Р. М., Федорова, Н. Д., Бок, Дж. У., Крамер, Р. А., Вортман, Дж. Р., Ким, Х. С. и др. (2007). Транскрипционная регуляция химического разнообразия у Aspergillus fumigatus с помощью LaeA. PLoS Pathog. 3: e50. DOI: 10.1371 / journal.ppat.0030050

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ревербери, М., Gazzetti, K., Punelli, F., Scarpari, M., Zjalic, S., Ricelli, A., et al. (2012). Aoyap1 регулирует синтез OTA, контролируя окислительно-восстановительный баланс клеток в Aspergillus ochraceus . Заявл. Microbiol. Biotechnol. 95, 1293–1304. DOI: 10.1007 / s00253-012-3985-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмидт-Хейдт, М., Боде, Х., Раупп, Ф., и Гейзен, Р. (2010). Влияние света на биосинтез охратоксина Penicillium . Mycotoxin Res. 26, 1–8. DOI: 10.1007 / s12550-009-0034-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмидт-Хейдт, М., Граф, Э., Штолл, Д. и Гейзен, Р. (2012). Биосинтез охратоксина Penicillium как один из механизмов адаптации к пище, богатой NaCl. Food Microbiol. 29, 233–241. DOI: 10.1016 / j.fm.2011.08.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмидт-Хейдт, М., Руфер, К., Раупп, Ф., Брухманн, А., Перроне, Г., и Гейзен, Р. (2011). Влияние света на пищевые грибы с акцентом на виды, продуцирующие охратоксин. Внутр. J. Food Microbiol. 145, 229–237. DOI: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2010.12.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Селуан А., Буйя Д., Лебрихи А., Декок К. и Бусета А. (2009). Влияние некоторых факторов окружающей среды на рост и продукцию охратоксина А / by Aspergillus tubingensis , A.niger и A. carbonarius , выделенные из марокканского винограда. J. Microbiol. 47, 411–419. DOI: 10.1007 / s12275-008-0236-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Таниваки, М. Х., Питт, Дж. И., и Маган, Н. (2018). Aspergillus видов и микотоксинов: встречаемость и значение в основных пищевых продуктах. Curr. Opin. Food Sci. 23, 38–43. DOI: 10.1016 / j.cofs.2018.05.008

CrossRef Полный текст | Google Scholar

ван дер Мерве, К.Дж., Стейн, П. С., Фури, Л., Скотт, Д. Б., и Терон, Дж. Дж. (1965). Охратоксин А, токсичный метаболит, продуцируемый Aspergillus ochraceus Wilh. Природа 205, 1112–1113. DOI: 10.1038 / 2051112a0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вейга, Т., Найланд, Дж. Г., Дриссен, А. Дж., Бовенберг, Р. А., Тоув, Х., ван ден Берг, М. А., и др. (2012). Влияние бархатного комплекса на продукцию транскриптома и пенициллина G в ограниченных по глюкозе культурах хемостата бета-лактамного высокопродуктивного штамма Penicillium chrysogenum . OMICS 16, 320–333. DOI: 10.1089 / omi.2011.0153

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wang, G., Liu, Z., Lin, R., Li, E., Mao, Z., Ling, J., et al. (2016a). Биосинтез лейциностатинов антибиотиков у биоконтрольных грибов Purpureocillium lilacinum и их ингибирование на Phytophthora , выявленное с помощью анализа генома. PLoS Pathog. 12: e1005685. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1005685

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, Ю., Лю Ф., Ван, Л., Ван, К., Селварадж, Дж. Н., Чжао, Ю. и др. (2018a). pH-сигнальный фактор транскрипции AopacC регулирует биосинтез охратоксина A у Aspergillus ochraceus . J. Agric. Food Chem. 66, 4394–4401. DOI: 10.1021 / acs.jafc.8b00790

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wang, Y., Wang, L., Liu, F., Wang, Q., Selvaraj, J. N., Xing, F., et al. (2016b). Грибы, продуцирующие охратоксин А, пути биосинтеза и механизмы регуляции. Токсины 8. doi: 10.3390 / toxins8030083

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wang, L., Wang, Y., Wang, Q., Liu, F., Selvaraj, J. N., Liu, L., et al. (2015). Функциональная характеристика новых генов поликетидсинтазы, участвующих в биосинтезе охратоксина А у Aspergillus ochraceus fc-1. Токсины 7, 2723–2738. DOI: 10.3390 / toxins7082723

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, Ю., Wang, L., Wu, F., Liu, F., Wang, Q., Zhang, X., et al. (2018b). Консенсусный путь биосинтеза охратоксина А: данные о последовательности генома Aspergillus ochraceus и сравнительный геномный анализ. Заявл. Environ. Microbiol. 84, pii: e01009-18. DOI: 10.1128 / AEM.01009-18

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уильям, Э. Х., и Гамильтон, П. Б. (1979). Микотоксины — их биосинтез в грибах: охратоксины — метаболиты комбинированных путей. J. Food Prot. 41, 815–820.

Google Scholar

Ву Д., Оидэ С., Чжан Н., Чой М. Ю. и Турген Б. Г. (2012). ChLae1 и ChVel1 регулируют продукцию Т-токсина, вирулентность, реакцию на окислительный стресс и развитие патогена кукурузы Cochliobolus heterostrophus . PLoS Pathog. 8: e1002542. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1002542

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан, Дж., Чен, Х., Сумара, М.В., Гао, К., Ван, Д., Чжан, Ю. (2018). Ген veA действует как положительный регулятор продукции конидий, биосинтеза охратоксина А и устойчивости к окислительному стрессу у Aspergillus niger . J. Agric. Food Chem. 66, 13199–13208. DOI: 10.1021 / acs.jafc.8b04523

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Транскриптомные, ДНК-белковые и метаболические исследования VosA, VelB и WetA в бесполых спорах Aspergillus nidulans

У нитчатых грибов бесполое развитие включает клеточную дифференциацию и метаболическое ремоделирование, ведущее к образованию интактных бесполых спор.Развитие бесполых спор (конидий) у Aspergillus точно координируется множеством факторов транскрипции (TF), включая VosA, VelB и WetA. Примечательно, что эти три TF необходимы для структурной и метаболической целостности, то есть для правильного созревания конидий у модельного гриба Aspergillus nidulans Чтобы получить механистическое понимание сложных регуляторных и взаимозависимых ролей этих TF в бесполом спорогенезе, мы выполнили многопрофильные исследования транскриптома, взаимодействия белок-ДНК, а также первичного и вторичного метаболизма с использованием A.nidulans конидии. Секвенирование РНК и анализ секвенирования иммунопреципитации хроматина показали, что три ТФ прямо или косвенно регулируют экспрессию генов, связанных с передачей сигнала гетеротримерного G-белка, киназами митоген-активированного белка (MAP), образованием и структурной целостностью споровых стенок, бесполым развитием и первичный / вторичный метаболизм. Кроме того, метаболомический анализ конидий дикого типа и отдельных мутантных конидий показывает, что эти три ТФ регулируют широкий спектр первичных метаболитов, в том числе тех, которые входят в цикл трикарбоновых кислот (ТСА), определенные аминокислоты и трегалозу, а также вторичные метаболиты, такие как стеригматоцистин. , эмерицелламид, остинол и дегидроаустинол.Таким образом, WetA, VosA и VelB играют взаимозависимые, перекрывающиеся и различные роли в управлении морфологическим развитием и первичным / вторичным метаболическим ремоделированием в конидиях Aspergillus , что приводит к образованию жизненно важных конидий, подходящих для размножения и распространения грибов. ВАЖНОСТЬ Нитчатые грибы производят огромное количество бесполых спор, которые действуют как эффективные пропагулы. Из-за своей инфекционной и / или аллергенной природы споры грибов влияют на нашу повседневную жизнь. Aspergillus видов продуцируют бесполые споры, называемые конидиями; их формирование включает морфологическое развитие и метаболические изменения, а связанные с ними регуляторные системы координируются множеством факторов транскрипции (TF). Чтобы понять лежащие в основе глобальные регуляторные программы и клеточные результаты, связанные с образованием конидий, на модельном грибе Aspergillus nidulans были выполнены геномный и метаболомный анализы. Наши результаты показывают, что специфичные для грибов ТФ WetA / VosA / VelB регулируют координацию морфологических и химических развития во время спорогенеза.Результаты этого исследования дают представление о взаимозависимых, перекрывающихся или различных генетических регуляторных сетях, необходимых для образования интактных бесполых спор. Полученные данные относятся к другим видам Aspergillus , таким как основной патоген человека Aspergillus fumigatus и продуцент афлатоксина Aspergillus flavus .

Ключевые слова: Aspergillus; WetA; бесполое развитие; генетическая регуляторная сеть; вторичные метаболиты; спороношение; фактор транскрипции; бархат.

О КОМПАНИИ | KAY VEL

Покойный Сполдинг Б. Сеттл, старший основатель и первоначальный владелец линейки продуктов Kay Vel и провидец, является одним из первых производителей средств по уходу за черными волосами в Соединенных Штатах. Сполдинг Сеттл начал свою карьеру в этой отрасли еще молодым человеком с мадам Си Джей Уокер, которая разработала и спроектировала первую выпрямляющую расческу.

Позже, Сполдинг Сеттл, старший продавал Помаду Мюррея, которая сегодня продается по всему миру. Г-н Сеттл черпал вдохновение из изобретения мадам Си Джей Уокер и введения гребня для пресса.Профессиональные парикмахеры столкнулись с плохой рабочей средой, которая отрицательно сказалась на их здоровье из-за использования низкокачественных прессовых масел и обычных прессовых продуктов. Некоторые из этих продуктов все еще присутствуют на рынке.

В середине 1940-х годов Spaulding Settle Sr. разработал оригинальный пресс для кремов Kay Vel Creme Press, который был полезен как косметологам, так и их клиентам для бизнеса и личного пользования. Kay Vel Crème Press был безопасным, бездымным и обезжиренным натуральным средством для кондиционирования волос против поврежденных чрезмерно обработанных волос.Kay Vel crème Press можно использовать с меньшим нагревом, чем все обычные масла для прессования. Клиенты косметолога испытали настоящее омоложение своих волос и блестящие прически, которые сохранили высокий блеск, но при этом остались нежирными.

В 1989 году прошел Сполдинг Сеттл-старший, что привело к исчезновению его мечты и видения. Его сын Кеннет Селт унаследовал Кей Вел Продактс и возможность еще раз возродить своего отца Сполдинг Селтл, мечту и видение старшего, которые он также разделял как свои собственные.

Кеннет Сеттл-старший отказался позволить умереть дизайну продукта, бизнес-мечте и видению своего покойного отца. Кеннет Сеттл продолжал работать над своей мечтой и видением — продолжить линейку продуктов Kay Vel на текущем рынке. Кеннет Сеттл перенес производство из Нью-Джерси в Мэриленд и в настоящее время находится в Гастонии, Северная Каролина, где линия продуктов Kay Vel производится на месте и распространяется со склада, снова доступная для лояльного рынка клиентов, сохраняющих оригинальную рецептуру продукта.

Последней формой рекламы продукта Kay Vel была реклама Ebony Ad 1965 года, с тех пор о ней говорила молва уже более сорока лет. Кроме того, мы сталкивались с тем, что другие компании безуспешно пытались скопировать Kay Vel Creme Press. Мы счастливы и с гордостью сообщаем, что существует только один Crème Press, и это Kay Vel Crème Press.

Сегодня в KAY VEL PRODUCTS LLC мы фокусируемся на обслуживании сегодняшнего рынка с оригинальным естественным подходом к выпрямлению или завивке волос с помощью линейки продуктов Kay Vel.С Kay Vel Creme Press клиент может использовать плоский утюг для укладки со средним нагревом, расческу или фен, чтобы получить мягкую, послушную и прямую прическу без использования агрессивных химикатов. Они могут уложить волосы в любой желаемый стиль. Кроме того, с помощью Kay Vel Curl Wave клиент может использовать щипцы для завивки волос, что приводит к получению водоотталкивающей прически. Они могут как укладывать, так и кондиционировать волосы естественно и безопасно. Продукты Kay Vel в течение многих лет были известны как секрет косметологов, и женщины часто приходили делать прически, а косметолог закрывал банку, чтобы никто не узнал их секрет мягких роскошных причесок.

Kay Vel Products LLC производит и распространяет продукцию Kay Vel как на профессиональных, так и на развивающихся потребительских рынках в США и на мировых рынках. Kay Vel Products LLC готовится к запуску потребительской линии на латиноамериканском глобальном рынке

Liber B vel Magi

Карта диапазонов VELB и CELB в Калифорнии. Отдельные точки показывают …

Контекст 1

… долинный усачий бузинный жук (ВЭЛБ) — древовидный подвид жука семейства Cerambycidae, встречающийся только в Центральной долине Калифорнии, США [1] (рис. 1). Подвид имеет половой диморфизм, самцы демонстрируют красно-оранжевые надкрылья (покровы крыльев) с четырьмя темными продолговатыми пятнами, а самки демонстрируют надкрылья от темно-зеленых до черных с яркими красно-оранжевыми краями [2]….

Контекст 2

… CELB не указан как находящийся под угрозой исчезновения, хотя этот подвид менее изучен, чем VELB. CELB населяют прибрежную Калифорнию, части Сьерра-Невады, а также центральную и южную часть долины Сан-Хоакин и южнее, включая высоко урбанизированные районы Лос-Анджелеса и Сан-Диего [2,19,20] (рис. 1). Ареалы VELB и CELB перекрываются вдоль восточной границы Берегового хребта, и наблюдались промежуточные формы [2,8,16]. …

Контекст 3

…. фрагменты фрагментов идентичны музейным образцам, собранным в близлежащих местах. Один образец Frass, собранный из южной части диапазона VELB, показал 100% идентичность последовательности с музейными образцами VELB / CELB из диапазонов VELB и северных CELB (рис. 1, верхняя стрелка и S3, рис.). Два образца Frass, собранные примерно в 300 метрах друг от друга в округе Сан-Бернардино в южной Калифорнии, в южной части диапазона CELB, показали 100% идентичность последовательности с музейными образцами CELB, собранными в южной Калифорнии (рис. 1, нижняя стрелка и рис. S3). ….

Контекст 4

… образец Frass, собранный из южной части ареала VELB, показал 100% идентичность последовательности с музейными образцами VELB / CELB из диапазонов VELB и северных CELB (рис. 1, верхняя стрелка и S3 Рис). Два образца Frass, собранные примерно в 300 метрах друг от друга в округе Сан-Бернардино в южной Калифорнии, в южной части диапазона CELB, показали 100% идентичность последовательности с музейными образцами CELB, собранными в южной Калифорнии (рис. 1, нижняя стрелка и рис. S3). ….

Контекст 5

… эти проблемы, последовательности, полученные из трех образцов фрагментов, точно совпадали с ссылками, полученными из музейных образцов VELB / CELB, что настоятельно предполагает косвенное генетическое обнаружение.