Если таков был, грубо говоря, состояние дел в том, что всегда оставалось относительно непонятной отраслью обучения, то в последние десятилетия религия резко выдвинулась в общественной повестке дня как объект политической озабоченности. В контексте, измененном увеличением иммиграции в Европе и Kulturkampf в Америке, а также усилением имперских операций обоих, четыре тревожные тенденции теперь населяют поле. С одной стороны, постколониальные позиции породили значительную литературу, отвергающую саму идею «религии» как плод воображения ориенталистов, объединяющую воображаемый ислам, индуизм, буддизм или конфуцианство для колониальных целей Запада.В противовес этим серьезным западным отрицаниям любой необходимой связи между современностью и секуляризацией — есть протестантская и католическая версии этого — приветствуют настойчивость или возрождение различных разновидностей христианства как доказательство того, что вера в божественное, к счастью, столь же сильна, как и Когда-либо. В третьем варианте, на более высоком уровне, где Тейлор и Дворкин объединяются, философия веры убеждает читателей в том, что что бы они ни думали, религия по-прежнему является духовным трамплином в их жизни, в то время как философия неверия информирует их о жизненной необходимости религия, даже если они могут обойтись без бога.И последнее, но не менее важное, — это утверждение — резонансное заявление Ролза и Хабермаса, множество официальных заявлений — о том, что все основные религиозные вероисповедания в основном едины, разделяя сокровищницу общих ценностей с либеральным гуманизмом в «постсекулярную эпоху»: уникальное небесное единство. , чтобы соответствовать земной версии ниже, закрепленной в бесчисленных электронных учебниках по вероисповеданию мира. Подвариант объединяет социологию Парсонса с философией Ясперса, удивляясь одновременному появлению трансцендентных верований — греческого, еврейского, китайского, индийского — в Осевую Эру религиозного пробуждения, эволюционного скачка на пути человечества к современности. счастливыми наследниками которых мы до сих пор являемся.

Религия процветает; религия везде; религия едина; даже не называйте это религией. Все так или иначе безупречно правы, все защищают свой объект. Только второй допускает вообще какие-либо сравнения. Но обычно они представляют собой не более чем регистры степени, в которой различные западные общества цепляются за свои деноминации, и причин, по которым некоторые — особенно Соединенные Штаты, — похвально, сделали это более решительно, чем другие.Тот факт, что секуляризация неослабевает во всем развитом мире, сейчас настолько игнорируется, хотя и настолько очевидна, что истина, уравновешенная демонстрация ее в неопровержимых деталях — включая Соединенные Штаты — должна быть озаглавлена ​​ В защиту немодной теории. В такой ситуации неудивительно, что наследие Вебера должно быть со скидкой. Фактически, серьезное сравнительное изучение основных мировых религий теперь почти табуировано; Рискованный анализ различий во взглядах несовместим с политкорректностью — вялой или резкой, как это может быть — того периода.Максимум осторожной осторожности превратился в тик невысказанной фобии: сравнения никогда не были более одиозными.

В России при Брежневе, конечно, ничего из этого не получалось. Однако не было легкого доступа к западной науке в этой области, классической или современной. В условиях изоляции, как заметил сам Фурман, русские мыслители его поколения неизбежно в какой-то степени были самоучками, всегда склонными изобретать велосипед заново. Фурман также, как заметил его друг и лучший комментатор Георгий Дерлугян, по темпераменту был прагматичным исследователем, мало интересовавшимся интеллектуальными генеалогиями или вовлечением в параллельные работы.Таким образом, остается неясным, как далеко он начал писать, сознательно или иначе, вслед за Вебером, и действительно, насколько он знал о своей работе в то время. В любом случае, вероятно, по чистой случайности, а не по влиянию, его начальный выбор тем совпал с выбором Вебера. Его первая книга, Религия и социальные конфликты в США (1981), была сосредоточена на роли протестантизма в американской истории и обществе, а вскоре после этого была дополнена эссе об идеологии Реформации в Европе раннего Нового времени.Протестантская этика Вебера , написанная незадолго до и после его поездки в США в 1904 году, ставила своей целью показать, что внутренний аскетизм пуританских доктрин был решающим условием подъема капитализма на Западе — в сущности, хотя Позже он будет отрицать это — критическую дифференциальную особенность , отделяющую развитие Запада от остального мира. Для Фурмана это было слишком узким видением: последствия раскола в латинском христианстве были не просто или даже в основном экономическими, но гораздо более широкими, и подходящей основой для их рассмотрения был не капитал как таковой, а современное буржуазное общество как целое.В то время как Вебер свел стремление протестантского богословия к понятию «призвание» — его собственная навязчивая идея, коренящаяся в биографических корнях, которую он переоценил в обратном направлении, — Фурман определил ее взрывную динамику не в сфере воли, а в области знания.

Исторически христианство как мировая религия характеризовалось крайним «антиформализмом» учения его основателя. Иисус не оставил письменных текстов и не более нескольких притч. Не его проповедь, а чудо его смерти и воскресения было откровением, определившим новую веру.Однако однажды сообщество верующих выросло до такой степени, что оно включало в себя правителей империи, построение универсальной церкви потребовало кодификации веры, которая со временем произвела полную противоположность ее первоначальной антиформалистической простоте — исключительно разветвленная формализация доктрины, наложенная на сами бесхитростные евангелия, сама ее жесткость, одновременно предупреждающая крышка над котлом изначальных импульсов, все еще кипящих внизу, и психологическая компенсация за них.Как и во всех основных религиях, утверждал Фурман, эта формализация в конечном итоге привела к восстанию, требующему возврата к своему первоначальному вдохновению. Отличительной чертой протестантизма было то, что его поворот к прошлому открыл логику будущего. Потому что, отвергая институциональный авторитет церкви во имя Священных Писаний, реформаторы — ученые без харизматического авторитета, ни святые, ни пророки — невольно открыли дверь для своего толкования кем-либо.

Эпистемологически синтез средневековой церкви древнего философского рационализма и христианской мифологии никогда не был полностью стабильным, но он давал исчерпывающее описание этого мира и будущего, а также пути верующего от одного к другому.Протестантизм, отказавшись от этой сложной космологии в пользу простой буквы Священных Писаний, был якобы регрессивным. Но из его иррациональных посылок были сделаны недогматические выводы. Поскольку в самой Библии относительно мало говорится о мире природы, эмпирическая наука могла развиваться, не сдерживаясь аксиомами Аристотеля, а поскольку она могла еще меньше сказать о многих проблемах современной жизни, возникла зона этической неопределенности, в которой только индивидуальная совесть могла быть проводником — пуритане с такой силой цепляются за горстку библейских предписаний, потому что в противном случае у них было так мало перил безопасности.Невольным результатом было огромное высвобождение человеческой энергии, ведущее со временем к реконструкции всех сфер общественной жизни. Веберовская концепция протестантской этики предлагала психологию капиталистического предпринимателя, но изменение денежных движений было в лучшем случае второстепенным аспектом Реформации. Сам капитализм был гораздо более сложным явлением, чем экономика, основанная на частном предпринимательстве, включающая унитарную социально-экономическую формацию, производственные отношения которой не могли бы существовать без производственных сил, которые включали новые уровни науки и техники, народное образование, национальное сознание, правовые и политические гарантии частной собственности.

Протестантизм был связан со всеми этими взаимодействующими элементами. Достаточно было подумать о его настойчивых требованиях переводить и читать Библию на местном языке, чтобы увидеть его влияние на рост массовой грамотности и национальной идентичности. Однако критически важной в конечном итоге была его роль в обеспечении появления — до заводов, лабораторий или выборов — нового типа людей, доверяющих своим собственным суждениям, но рассматривающих свои выводы как ошибочные и допускающих собственные моральные ошибки.Этот протобуржуазный индивид был культурно-исторической предпосылкой всех процессов капиталистического развития. Не то чтобы сами реформаторы когда-либо предполагали это. Стремясь придать новую форму антиформальным импульсам раннего христианства, они не могли не повторить в некоторой степени траекторию католической церкви, которая вскоре сама разделилась в догматических спорах. Но кора их формализаций была намного слабее, магма под ней извергалась легче. С одной стороны возникли новые секты, с другой — скептическое религиозное безразличие.Под двойной атакой протестантский центр не выдержал, и пришло терпение.

Каковы были последствия в Новом Свете? Книга Фурмана о Соединенных Штатах предлагает подробную эмпирическую социологию американских церквей, деноминаций и сект в 20 веке. С этого момента его внимание стало отличительной чертой его сравнительной работы: влияние религии не на экономическую, а на политическую жизнь общества. Во время своей поездки в США Вебер обратил внимание на роль протестантских сект в поддержании гражданских объединений в стране, но это был мимолетный интерес: такие источники активной жизни, как он думал, обречены на то, чтобы их настигла та же самая общие процессы бюрократизации, которые оказались столь безжалостными в Европе.Обеспокоенность Фурмана была оформлена совсем иначе. Почему, спросил он вначале, Франция знала четыре революции с 18 века и около 15 конституций, а Соединенные Штаты — только по одной из каждой? Может ли религия иметь к этому какое-то отношение?

Буржуазное общество в Америке, утверждал он, с самого начала сочетало исключительный динамизм с чрезвычайной стабильностью: комбинацию, которую нельзя было понять, если не считать особой важности протестантизма в его формировании. Потому что, с одной стороны, было неограниченное стремление к знаниям (Гарвард, основанный в течение 16 лет после приземления Mayflower , девять колледжей и сорок печатных станков к 1769 году, когда в Англии оставалось всего два университета) и все же отвращение к абстрактному мышлению — практичность становится мерой познания, а успех — его материальным признаком в неограниченном процессе развития, сама гибкость которого предохраняет социальный порядок от потрясений.С другой стороны, было библейское уважение к неизменности конституции, рассматриваемой так, как если бы это был не только закон страны, но и закон Господа, одновременно превосходящий волю людей и обеспечивающий компенсацию эмоциональной пустоты человека. революция, задачи которой были политически ограничены в обществе поселенцев без феодализма или абсолютизма. Эта страна оставалась настолько пропитанной религией, что в разгар «холодной войны» больше американцев отождествляли коммунизм с атеизмом, чем с отменой частной собственности.Хотя официально церковь и государство были разделены, господствующая идеология нации смешивала религиозные ритуалы и символы со светскими формами и темами в беспорядочной попурри, само отсутствие четких разделений или границ допускало постоянные экономические и социальные изменения.

На этих порогах церкви сами развивались, не только приспосабливаясь к ним, но даже временами (Движение за гражданские права) ускоряя их, хотя, как правило, в прагматическом стиле, нейтрализуя более радикальные преобразования.Если оставить в стороне секты, принадлежность к основным конфессиям теперь была вопросом семейной традиции, а не доктринальной дифференциации. Если чем выше классовая принадлежность церкви (и, следовательно, ее образовательный уровень), тем более либеральна ее ориентация, при которой духовенство обычно опережает мирян, это лежит в самой логике религиозной реформы, которая не ограничивает динамику научных исследований. знание не могло избежать последствий для собственной системы убеждений. После разрушения множества унаследованных моральных заповедей и мифов в 1960-х годах в 1970-х годах началась консервативная реакция, которая привела к политическому и теологическому повороту вправо, а также к разного рода контркультурным причудам.Но к настоящему времени секуляризацию ценностей — опросы показали, что большинство американцев уже приняли идею черного президента, если еще не представляют себе однополые браки, — остановить нельзя. Имманентное развитие веры разрушало основы, на которых она покоилась. Если буржуазный порядок сохранится в Соединенных Штатах, необходимо будет найти новые формы и средства интеграции личности и общества.

После Протестантская этика , Вебер приступил к первому из своих сравнительных исследований религии, с работы о ее формах в Китае, которая закончилась расширенным контрастом между конфуцианством и пуританством.И здесь его внимание было сосредоточено на экономике: почему имперский Китай не смог развить капитализм, как это сделал Запад? Он утверждал, что конфуцианству недостает жизненно важного императива религии спасения — соблюдения «методичного образа жизни», который породил аскетическую преданность пуританского предпринимателя к накоплению в Европе. Его форма рационализма была слишком сдержанной и ритуалистической, неспособной в достаточной мере освободиться от магии, свирепствующей в субкультуре даосизма, популярного дополнения, которое она никогда не могла подавить.Тем не менее — здесь Вебер допустил то, что он заключил в европейские скобки — ограничения китайской религии были не главными движущими силами, а продуктом социальной конфигурации. Структурно, а не только психологически, возникновение капитализма блокировало постоянное господство родовой бюрократии на фоне отсутствия феодалов, свободных городов и автономной церкви.

Поменяв порядок своих расследований, Фурман на самом деле писал о конфуцианстве до того, как занялся протестантизмом, соавтором замечательного эссе — более систематизированного, чем у Вебера, — в 1974 году, когда ему было чуть за тридцать.Он был знаком с Протестантская этика к тому времени, когда работал над Реформацией и религией США, но менее ясно, знал ли он о работах Вебера о Китае. Во всяком случае, его анализ конфуцианства, по пунктам сопоставленный с христианством, был весьма отчетливым. Исторически каждое из двух вероучений было ответом на кризисы в предшествующем порядке. В Палестине иудаизм всегда опирался на антиномию: Бог был универсальным, но выбрал только одну небольшую общину в качестве своего избранного народа.Завоевание Римом нанесло серьезный удар по этому притязанию. Политическое сопротивление оказалось бесполезным; трижды евреи поднимали восстание против римского владычества и каждый раз были подавлены. Но был религиозный путь выхода из кризиса в учении Иисуса, экстатика, который верил в свою собственную божественность, которую Павел мог превратить в веру за пределами иудаизма, больше не определяемую отношениями между Богом и его народом, но Богом и индивид: религия, в которой единственной заповедью было не соблюдение Закона, а любовь к Всевышнему.

В Китае, во время единственного в истории страны периода длительного внутреннего разделения, когда царство покойного Чжоу было разделено на соперничающие государства, вступившие в войну, Конфуций — мудрец, а не экстатик — предложил решение широко распространенного мнения моральный и социальный упадок с видением порядка, основанным, как и у Павла, на переработке более ранней традиции, но совсем другой. В религии Чжоу отсутствовали не только фетишизация объектов в природе или антропоморфный пантеон богов, но и любое личное божество иудейского типа.Только безличный порядок неба был божественен: обитель истины, мудрости и справедливости, но холоден и безразличен к людям. Недружелюбный для любой мифологии, его поклонение не порождало специализированного собрания жрецов, его ритуалы возлагались на чиновников в качестве вспомогательной функции их работы. На земле благоговение прежде всего было связано с предками.

Конфуций, представленный учениками спустя долгое время, изменил это наследие гораздо меньше, чем Павел нарушил Тору. Сохранились абстрактное представление о небе и культ предков.Но то, что уже было дрейфом древней религии в сторону морально-ритуального рационализма, в котором общество было задумано по модели патриархальной семьи, было развито и систематизировано в этической доктрине, которую он проповедовал. Высшими ценностями были знания (в отличие от понимания), долг и самообладание, в гармонии которых музыка была ритуальным выражением. Основной обязанностью было уважение к другим в соответствии с их рангом. Правители получали послушание со стороны своих подданных, как родители — со своими детьми, а мужья — со своими женами.Но если они не выполнят свои обязанности хорошего правительства, они утратят мандат Небес и могут быть смещены. В этой космологии приоритеты существования были земными. Не доверяя метафизике, Конфуций отказался строить предположения о существовании загробной жизни. Откровения не было, и плоть не была грешной. Время было несовместимым, но лекарство от него было простым: «исправление имен» для восстановления истинной связи между словами и вещами, правилами и делами, как они существовали тысячи лет назад при легендарных королях-мудрецах Яо, Шун и Ю.С помощью этой доктрины культу предков был придан решительный поворот, чрезвычайно усиливший интеллектуальную ориентацию на прошлое и закрепивший воображаемый социальный порядок в начале времен как неизменный стандарт правильной жизни. Каким грядущим искуплением будет для христиан, давно минувшая эпоха стала для конфуцианцев.

В обоих случаях рунические высказывания основателей требовали институционального механизма для преобразования в формализованные вероучения: церковь в Европе, экзаменационная система в Китае, каждый из которых был ограниченным каналом социальной мобильности, но противоположным по их отношению к вере и власти. .Вооруженное тщательно продуманной теологией, утверждающей абсолютную истину, христианство не могло терпеть никакой альтернативной системы религиозных убеждений. По сравнению с этим конфуцианская доктрина была скудной, не только скудной онтологией, не говоря уже о гносеологии, но и недостатком в сфере эмоций или ответа на экзистенциальные проблемы. Чтобы удовлетворить психологические потребности, которые он не мог удовлетворить, как массы, так и литераторы — один открыто, другой в частном порядке — прибегали к буддизму или даосизму на разных уровнях сложности.После того, как конфуцианство больше не сталкивалось с какими-либо проблемами в качестве официальной доктрины, после Тан, конфуцианство могло сосуществовать с этим безмятежным. Ученые-дворяне, которые управляли государством, были вначале администраторами и лишь во вторую очередь идеологами: их энергия не была сосредоточена на вопросах веры. Не было сварливых церковных соборов, а лишь спорадические преследования ведьм. Они могли позволить себе быть менее строгими.

В государственных вопросах роли поменялись местами. Раннее христианство не интересовалось делами этого мира.Иисус повелел принять любую политическую власть и почти не оставил никаких социальных учений. С другой стороны, конфуцианская этическая система была прежде всего социальной доктриной. Политическая власть была приемлемой только в том случае, если она соответствовала этому. На практике, чтобы закрепиться в качестве официальной идеологии государства, конфуцианство было вынуждено пойти на компромисс с легализмом — основанием мысли, которое в принципе было анафемой для него, которое отделяло осуществление власти от морали и обычаев, — и со временем стало уделять особое внимание долгу на практике. за счет сочувствия, а не в качестве инструкции к нему, в авторитарном синкретизме, который не терпел инакомыслия.В Европе, наоборот, не имея собственных развитых юридических или политических аксиом, христианство могло уживаться со светской властью в любом количестве форм — германские кодексы, римское право, французский абсолютизм — без чрезмерного напряжения, пока оно обладало монополией. религиозной веры. Конфликты между верой и властью возникли в обеих системах. Но в Китае они изначально были более ограниченными. Должностные лица были обязаны критиковать правителей, которые — испорченные евнухами или придворными — отклонялись от конфуцианских норм, при необходимости поплачивая за это своей жизнью; а если вырождение зашло слишком далеко, ученые могли присоединиться к крестьянским восстаниям против них или даже возглавить их.Но в отсутствие какой-либо последовательной политической альтернативы циклическое свержение династий скорее усилило, чем ослабило конфуцианскую монополию легитимности, превратившись не в механизм социальных изменений, а в социальное регулирование, действие которого заключалось скорее в стабилизации установленного порядка. На Западе столкновения между церковью и государством — не говоря уже о войнах между государствами противоположной конфессии после разделения христианства — имели гораздо более серьезные последствия.

Исторически конфуцианство было более рациональной системой верований, чем христианство, и долгое время более терпимой, ближе к современному гуманизму.Но эта толерантность была также выражением практического характера его разума, его безразличия к абстрактной истине. С другой стороны, для христианства истина была трансцендентной ценностью: откровением личного Бога. Христианская нетерпимость коренится в абсолютизме этой концепции истины, непримиримость которой в конечном итоге оказалась более благоприятной для возникновения науки. То же самое было с сотериологией будущего, а не с идолопоклонством прошлого. Психологически, отвечая не на внешний диктат обычаев, а на внутренний голос совести, личность, в конечном счете возникшая в результате Реформации, была более сложной и менее интегрированной, но также более свободной, чем ученый-конфуцианец, связанный по рукам и ногам ритуалами и этикетом.В этом отношении, заключил Фурман, христианство оказалось более гостеприимным, чем конфуцианство, для культурного творчества и социальных изменений. Не было задействовано никаких оценочных суждений, только одно из относительных значений их идеалов в развитии их земель.

Написанное во время Культурной революции, в период максимальной напряженности между Советским Союзом и Китаем, эссе Фурмана воздерживается от комментариев по поводу политического наследия конфуцианства. У него не было ни малейшей симпатии к маоизму, но он также опасался синофобии, свирепствовавшей в России в то время, в этом случае — его дебюте — воздерживаясь от современных выводов, которые присутствуют во всех его последующих работах о религии.Когда более десяти лет спустя он пришел писать об Индии, они занимали почетное место. Исследование Вебера индуизма и буддизма, отражающее очарование периода вильгельминской Германии индийским мистицизмом, было гораздо шире по охвату и богаче деталями, чем Протестантская этика . Однако его организационной заботой остается экономическая этика субконтинентальных конфессий. Фурман ссылается на это, но его реконструкция индуизма снова была sui generis. Древнейшая из всех основных религий, она имела уникально долгую историю, не имевшую ничего общего с путем от политеизма к монотеизму на Ближнем Востоке и на Западе.Что отличало индуизм, так это сочетание глубоких философских размышлений внутри религии (а не в отличие от нее) на элитном уровне с грубейшими формами магии и беспорядочным политеизмом на народном уровне. Метафизически не существовало единственного Бога, а скорее был безличный Абсолют, лежащий одновременно в основе души и мира, материальная вселенная которого была не более чем иллюзорным проявлением. Наивысшей ценностью было освобождение себя от цикла рождений и смертей в мокше : слияние глубокой основы личности с глубокой основой мира, достижимое только путем совершенствования в последовательных воплощениях, переходя от наследственных каст к другим. общественный строй был ритуально разделен.Религиозная истина была иерархической и эзотерической, непроницаемой для рационалистической критики или буквального несоответствия, доступной только элите браминов, но допускающей любое количество популярных культов и божеств.

Индуизм с такой структурой одновременно проявлял мягкую терпимость к различным мировоззрениям, которые можно было заключить в его объятия, и был яростно нетерпимым к любому нарушению ритуальных практик или сегрегации населения из-за фобий чистоты и загрязнения. Таким образом, индийское общество, разделенное по кастам, было в целом исключительно стабильным; бунтарство было редкостью.Как закрытые эндогамные группы, неспособные к объединению, касты могли управлять собой без необходимости вмешательства государства, конфликты между ними оставались локальными. На верхнем уровне иерархии, поскольку высшая каста браминов определялась эзотерическими знаниями, а не мирским авторитетом, политическая и военная власть могла со всей безжалостностью осуществляться кастой воинов, находящейся ниже их, но никогда не сакрализовалась. Вряд ли стоило записывать его анналы. История не представляла особого интереса: истинное время — невообразимо долгое — было внеземным.

Если такова была схема индуизма, термин, неизвестный его адептам до XIX века, реальность традиционных верований и практик в Индии всегда была более разнородной и разрозненной. Прибытие британцев сжало эти разросшиеся скопления в более единую систему. Под давлением Запада реформаторы-возрожденцы одновременно модернизировали и усилили традиционные привязанности среди элит, в то время как санскритизация стала формой восходящего движения в массах. Результатом стала новая мера сближения между элитой и народной верой, поскольку штаммы народного фундаментализма были введены в первую, импульсы западной демократизации — во вторую, постепенно создавая более однородную религиозную систему, на которой могло строиться движение за национальное освобождение.Черпая свою силу в религиозных символах, Индийский национальный конгресс завоевал такую ​​степенную независимость, к которой стремились его лидеры, омраченные разделом, но без каких-либо социальных катаклизмов, после чего возглавил устойчивую парламентскую демократию.

Это была конфигурация, резко контрастирующая с моделью в Китае, к которой Фурман вернулся в сравнительных размышлениях о двух системах примерно через пятнадцать лет после своего эссе о конфуцианстве. Индуизм выжил как вселенная эзотерических доктрин и популярных культов, где библейский конфуцианство потерпело крах, отчасти потому, что он обладал большей философской глубиной, но также потому, что он был артикулирован для каст, а не воплощен в государстве, следовательно, изолирован от разделения и слабости общества. государства на субконтиненте, допустившие быстрое британское завоевание при столь незначительном устойчивом сопротивлении.В Китае же, с другой стороны, государство было достаточно сильным, чтобы противостоять прямой колонизации, но когда династия перешла к внутреннему восстанию и центральная власть распалась, конфуцианство рассыпалось вместе с ним, оставив идеологический вакуум, который занял революционный марксизм. . Но хотя он был разрушен как священная система, его культурное наследие объективно сохранилось в коммунистическом — и более ярко, но гораздо менее эффективно — в националистическом Китае. Единство единого могущественного государства, внушающее единое морально-политическое учение, продолжало жить как нормальная форма правления.То же самое было с вековыми традициями народного протеста против коррупции и социальной несправедливости, проявившихся в Освобождении 1949 года, хаосе Культурной революции и расправе с бандой четырех, которая последовала за ней. В конфуцианские времена такие потрясения были гомеостатическими механизмами социального порядка, как саморегулирование каст было в индийском обществе. Но теперь, когда Китай успешно достиг высоких темпов роста, сопровождаемого усилением неравенства, потребность в социальной справедливости — все еще глубоко укоренившаяся среди населения — больше не была механизмом стабилизации.Китайцы многого ожидали от своего государства, и коммунистический режим еще не примирил эти два аспекта.

Взаимопроникновение новых институтов и старых убеждений было одинаково, хотя и совершенно иначе, отмечено в индийском парламентаризме. Формы этого институционального достижения были западными, а их содержание — нет. Идеологические и организационные принципы, которые выглядели так, как будто они пришли из Европы, имели другие основы. Конгресс был проводником «в высшей степени специфического индуистского секуляризма и весьма специфического индуистского демократизма».Истинная сила индийского парламентаризма заключалась в силе скрываемых им традиционных структур. Ключ к его стабильности лежал в доктринальной стойкости индуистского антиэгалитаризма, который защищал его распорядки от радикальных идеологий социальных изменений — как когда-то было традиционное индийское общество от крестьянских потрясений — путем подавления классовой борьбы, которая породила однопартийные режимы повсюду. в бывшем колониальном мире. Та же индуистская система ценностей была профилактикой и от других опасностей — военной диктатуры, поскольку воинам не хватало морального авторитета, зарезервированного для браминов или аскетов, и теократического правления в отсутствие какой-либо реальной ортодоксии или духовенства.Достаточно было рассмотреть Пакистан или Бангладеш, чтобы увидеть, напротив, наследие воинственных идеалов в исламе.

В этих условиях, подумал Фурман, индийцы приняли свое парламентское правительство не столько из идеологических убеждений, сколько из освящения его непарламентскими источниками власти — традиционным уважением к высшей кастовой элите, основополагающей ролью харизматического аскета, династической семьи. председательство над ним — и отсутствие какой-либо альтернативы. Секуляризация ослабляла некоторые из этих опор.Поскольку, размывая границы между кастами, он тем же ходом заострил границы полностью индуистской идентификации, угрожая индийскому парламентаризму ростом « этнических » конфликтов — в Кашмире, Нагаланде, Ассаме, Мизораме, Пенджабе — с которыми было трудно справиться. в рамках правовых норм либеральной демократии. Коммунализм поднялся там, где отступила каста. Нигде это не было яснее, чем в Пенджабе, которому Фурман посвятил следующее эссе.

Там сикхи мирно жили с индуистами, будучи одной из полуотколовшихся сект, которые индуизм традиционно охватил и терпел, хотя в условиях мусульманских преследований на одного политеиста меньше и он более воинственен, чем другие, но между ними не было четких границ.Однако, когда в конце 19 века возникли антикастовые движения, между индуистскими и сикхскими реформаторскими движениями развернулась конкуренция за лояльность неприкасаемых, что привело к созданию Акали Дал, сикхской партии, союзной с Конгрессом в борьбе против британцев. , но стремится максимизировать свою долю мест и власти в Пенджабе. Спустя двадцать лет после обретения независимости, под давлением создания языковых государств в других частях Индии, Конгресс признал раздел Пенджаба, предоставив сикхам штат, в котором они составляли большинство, и два других с индуистским большинством.Но по мере того, как секуляризация стирала религиозные границы между двумя общинами, а миграции пересекали границы штатов в обоих направлениях, сикхские опасения «утонуть в полностью индуистском море» не исчезли, а усилились, порождая требования о независимом Халистане и вооруженных. конфликт с центром.

В этом процессе по мере того, как кастовые идентичности приходили в упадок, обострялись конфессиональные антагонизмы, каждая сторона стремилась объединить свое сообщество с религиозными призывами. Сикхские неприкасаемые, некогда сторонники Конгресса, убили Индиру Ганди; Индусские неприкасаемые возглавили погромы мести.Однако с исторической точки зрения коммунизм, развязанный секуляризацией, был болезнью роста, которая пройдет по мере углубления. Индийский парламентаризм зародился из уважения к благочестивым традициям и обычаям, но, упорно продолжая свое существование, постепенно превратился в популярную принципиальную приверженность. Объективно индуистский характер индийского государства сохранился, но демократия все более и более укоренялась.

Нечто похожее на противоположную конфигурацию, утверждал Фурман, можно увидеть в отношениях между религией и политикой в ​​Израиле.Формально государство провозгласило принципы, определяющие любое демократическое правительство, поддерживая свободу совести и запрещая религиозную дискриминацию. Однако на практике он бросил вызов этим нормам с помощью массы религиозных правил, навязанных как верующим, так и неверующим, подчиняя повседневную жизнь заповедям ригористского иудаизма. В субботу были ограничены работа, транспорт и общественные услуги; бизнес, еда и даже археология были предметом других табу. Самым вопиющим был запрет на гражданский брак и запрет на любую свадьбу, в которой один из партнеров не исповедовал иудейскую веру.Только ортодоксальные раввины имели правовой статус, и именно они дали определение еврею. Любой еврей, отказавшийся от иудаизма в пользу другой веры, не мог подать заявление на получение израильского гражданства. Все это больше походило на Саудовскую Аравию или Иран, чем на какое-либо западное государство. Однако клерикализм государства противоречил секуляризму общества: столько евреев никогда не ступали в синагогу, сколько посещали ее раз в неделю. Как могло православное меньшинство, составляющее немногим более четверти общины, иметь такой непропорциональный вес?

Традиционный ответ заключался в том, что израильская система пропорционального представительства сделала религиозные партии существенными для формирования большинства правительств.«Наши руки были связаны», — сказал бы Бен-Гурион, оправдывая роль лейбористов в создании конфессионального государства. Но почему он согласился с клерикальным «шантажом», если его можно было избежать, объединившись с партиями, левыми от лейбористов? На самом деле, принятие Мапая клерикальных партий было вопросом принципа — правительство без них, как сказал коллега и преемник Бен-Гуриона Шаретт, было немыслимо; В их включении на карту было поставлено национальное единство, — заявил Перес. За этой позицией скрывается нечто большее, чем просто партийный расчет.Опросы регулярно показывали, что нерелигиозные евреи широко признают степень духовного контроля над жизнью Израиля. Национальное единство, задуманное как объединение евреев в Израиле, было высшей ценностью для партий всего спектра в контексте, когда восприятие внешних угроз создавало постоянное чувство кризиса, затмевающее все другие вопросы, превращая клерикализм в второстепенный вопрос для большинство населения. Однако это вряд ли объясняло, почему его принятие можно было считать вопросом принципа.Даже призывы к единству были менее чем убедительными, учитывая, что полномочия, предоставленные ортодоксальным евреям, означали постоянный отпор евреям-реформистам, большинству населения США.

Истинная причина, по которой клерикализм сохранил такую ​​власть в Израиле, лежит в другом, в самой природе иудаизма. Этническая религия, это была единственная связь, связывающая рассредоточенные группы евреев в России, Германии, Восточной Европе, на Ближнем Востоке и в Северной Африке, между которыми практически не было ничего общего.Таким образом, секуляризация представляла угрозу еврейской идентичности в отличие от любой обычной нации. Сионистский национализм враждебно относился к пассивному взгляду ортодоксального иудаизма на гетто, однако страх ассимиляции означал, что он никогда не сможет развернуть свою борьбу за Палестину без православных. Также после создания государства Израиль сионизм не мог разрешить такие трудноразрешимые вопросы, как определение еврея, не делегировав их православным, сохраняя якобы чистыми руки, переложив ответственность за религиозную дискриминацию на раввинскую власть при разделении труда, разрешающем его лидеры украсили Второй Интернационал.Реальность заключалась в том, что сионистские цели и демократические принципы противоречили с самого начала, поскольку сионистская программа могла быть реализована только путем игнорирования воли арабского большинства в Палестине и изгнания его из своих земель. Израиль был построен на изолированной структуре, подобной той, что была в Южной Африке или древнем американском Юге. Внешние угрозы были функциональными для поддержания этой структуры и маскировки ее внутреннего кризиса. Рано или поздно — Фурман писал это четверть века назад — израильтянам придется выбирать между последовательной демократией и последующим сионизмом.Эти двое не могли примириться.

Фурман пришел к исламу хронологически последним, в стиле, симметричном его первому исследованию конфуцианства, с систематическим сравнением его с христианством в послесловии к « На пути к исламской реформации » суданского мыслителя Абдуллахи Ахмеда Ан-На. ‘я. Основное различие между христианскими и мусульманскими верованиями заключается в контрасте между Иисусом и Мухаммедом как носителями новой религии. Для первых верующих содержание учения Иисуса было второстепенным по сравнению с вестью о его смерти и воскресении как божестве в высокоорганизованной Римской империи, авторитету которой он учил послушанию.Мухаммед, с другой стороны, был человеческим пророком, который создал новый свод законов и вдохновил воина, следующего за ним, объединить прежде бесформенный Аравийский полуостров. Не вера в Сына Божьего, а в текст, оставленный человеком, основавшим государство, определяет верных. Если Коран разделился на две части: аяты из Мекки, не сильно отличающиеся от догматов христианства или иудаизма, и аяты из Медины, более резко отделенные от них, устанавливающие подробные законы для протоарабского государства и призывающие к войне с неверующими, пришла традиция. чтобы удержать то, где они расходились, второе вытеснило первое.

Итак, когда для христианства наступило неизбежное время формализации, догматической дисциплине подверглись теологические доктрины, организация и ритуалы, а не сфера управления, которую оно оставило нерегулируемой. В исламе же, напротив, формализация происходила не в обстановке недавних преследований, а в условиях победоносной власти, основанной на письменных инструкциях для своего правительства. Раннее христианство раскололось из-за споров о Троице, ранний ислам из-за споров о том, кто должен быть халифом.Мухаммед умер до арабских завоеваний Ближнего Востока и Северной Африки, что потребовало решения многих вопросов, с которыми он никогда не сталкивался, для которых ученые со временем разработали свод правил шариата. Но статус этих религиозных профессионалов был скромнее, чем у духовенства в христианстве, статус правительства более священный. Здесь вектором догматизации была не церковь, а государство: первым религиозным спором, отделявшим будущих шиитов от будущих суннитов, была гражданская война за правопреемство халифата.

Если сравнивать средневековый ислам со средневековым христианским миром, очевидно, что мир, управляемый шариатом, был гораздо ближе к нормам современной западной жизни. Мусульманские общества были более эгалитарными: было меньше религиозных преследований, угнетение низших классов часто было мягче, положение женщин лучше, а культурный уровень выше. Но с наступлением эпохи Возрождения и Реформации произошел поворот: в Европе динамичное развитие сфер жизни, относительно не регулируемых религией — технологий, рынка, закона, правительства — ослабило формализацию самой веры, в то время как в мусульманском мире все социальные о формах и изменениях еще предстояло судить с помощью вневременной модели правления, кодифицированной шариатом, отступление от которой можно было заклеймить как bida — ересь.В то время как на Западе централизованная религиозная власть делала возможными изменения даже в вопросах догмы, допуская такие разработки, как схоластика, неформальный консенсус улемов привел к опасениям перед нововведениями.

Не то, чтобы в свое время ислам не сумел вызвать движения реформации, призывающие, как и в христианстве, вернуться к первозданной чистоте Священных Писаний. Конечно, не было такого резкого контраста между жизнью основателя и мирским вырождением папства эпохи Возрождения — халифы могли быть слабыми или коррумпированными как правители, но сам Мухаммед, в конце концов, имел 11 жен.Однако религиозные реформы в исламе на самом деле были легче психологически, чем в христианстве, поскольку не было массивной церкви, против которой можно было бы бороться, и была готовая модель правительства, к которой чистые могли вернуться. По тем же причинам они были менее значимыми, поскольку не открывали пути к более свободной мысли или обществу. Между лютеранством и ваххабизмом дистанция была огромной.

Когда соотношение политических сил слишком заметно изменилось в пользу Запада, первой реакцией в исламском мире было приобретение оружия, необходимого для сопротивления, с реформой армии в Турции, Египте и Иране (как ранее в Россия).Затем появились машиностроение и технологии, железные дороги и учебные заведения. Наконец, начали проникать и идеи: первая конституция была принята в Османской империи в 1876 году, первая республика в Азербайджане — в 1918 году. Но до сих пор масса верующих остается приверженной шариату, даже если они не живут по нему. Если движения социального протеста снова призывают к возвращению к нему, то теперь к ним присоединились культурные протесты от его имени против американизации. Из их слияния возник современный исламский фундаментализм.И все же в то же время прогресс секуляризации был очевиден в обычаях повсюду, не в последнюю очередь в хомейнистском Иране.

Между двумя силами фундаментализма и секуляризма возник тупик. Подобные предложения Ахмеда Ан-Наима и Мохаммеда Таха превзойти мединские части Корана, обусловленные обстоятельствами их периода, с вневременными принципами мекканских частей, представленными как полностью совместимые с современными демократическими нормами, были направлены на то, чтобы выйти из этого тупика с помощью чего-то вроде той же операции, что и реформаторы Европы 16-го века.Среди прочего они были знаком того, что преувеличивать проблемы мусульманского мира неправильно. Некоторые из них были, конечно, специфическими для нее, но дорога к современным демократиям в самой Европе была усеяна конвульсиями — нацизмом в Германии, фашизмом в Италии и Испании — столь же экстремальными, как и все, что можно увидеть в арабском мире. На Ближнем Востоке не было оснований для западного фарисейства.

Что, наконец, о религии в самой России? По легенде, в X веке в Киев прибыли четыре посланника, чтобы убедить его языческого князя в достоинствах своей веры: еврейский эмиссар из Хазарской империи, мусульманин из Булгарского ханства, католик из Рима, православный из Греции. Византия.Выбрав последнее, Владимир принес Руси ее форму христианства. Эта история, как заметил Фурман, была полумифом, полулитературным артефактом. Но это выражало историческую реальность. Однажды принятая религия была исключительно прочной. Османское правление не сделало сербов, греков или армян мусульманами, а европейская колонизация не сделала христианами индейцев, бирманцев или большинство индонезийцев. Какими бы ни были причины решения в Киеве, возможно, весьма условного, его последствия длились почти тысячу лет. Критический вариант был выбран скорее для восточной, чем для западной ветви христианства.К тому времени структура каждого из них принципиально различалась. Восточная была децентрализована и состояла из ряда церквей, патриархи которых завидовали их положению, но все подчинялись имперскому государству в Византии, тогда как западная была централизована под властью епископа Рима и сталкивалась с множеством государств. но не подлежал ни одному из них. В этих условиях первые стали политически податливыми, но доктринально жесткими — усилия, необходимые для достижения соглашения между различными церквями, были настолько изнурительными, что решения первых семи Вселенских соборов стали окончательными и не допускали дальнейших изменений, а во втором — богословское новшество. был по усмотрению папы.Такие интеллектуальные изменения были заблокированы на Востоке.

Более того, к раннему средневековью католическая церковь охватывала гораздо большее географическое и культурное пространство, чем православное христианство, и общалась через него на латыни. Русское православие, с другой стороны, сопротивлялось даже использованию греческого языка, язык его писаний и литургии оставался церковнославянским. Культурная изоляция усиливала идеологическую закрытость. Никакого аналога университетам или схоластической мысли Запада, никакого интереса к научным знаниям или образованию никогда не возникало.В конце концов, после падения Византии, Московия, презирая попытки греческого духовенства заключить с Римом компромисс с Римом в последнюю минуту, чтобы предотвратить завоевание Османской империи, стала единственным православным государством в мире. В результате была создана Русская Церковь, которая безоговорочно поддерживала русское самодержавие до тех пор, пока его богословие оставалось нетронутым. Цари могли совершать любые преступления или зверства — см. Иван IV — без малейшего упрека, но если священные книги обновлялись, начиналась виртуальная гражданская война.В XVII веке старообрядцы, восставшие против нечестивого патриарха, который так поступил, были маргинализованы, а когда в XVIII веке Петр I, совершенно незаинтересованный религиозными ссорами и угрызениями совести, превратил церковь в простой департамент государства, не было сопротивление. Екатерина II могла даже назначать вольтерянцев в руководящий синод.

К 19 веку результатом стало православие, которое доминировало в народном воображении и традициях, но практически не играло никакой роли в духовной жизни большей части интеллигенции.Комбинация формальной монополии на веру и фактическая слабость общества стала стимулом для церкви к распространению неверия. Для старообрядцев благословение тремя пальцами вместо двух могло быть кощунством, но для неверующих ни один жест ничего не значил. Полный отказ от религии стал проще и нормальнее, чем малейшее изменение в сфере веры. Вольтера или Маркса можно было опубликовать, когда русский перевод Библии был запрещен. Ни в одной другой стране Европы религия не была такой неизменной, но столь чуждой реальной жизни общества, а престиж церкви был настолько низким, что сыновья священника могли захотеть скрыть занятие своего отца из стыда за это.Так что нигде больше не было похоронен такой потенциал массового атеизма. Революция 1917 года подвела итоги девятисот лет русского православия. Мораль этой истории, подумал Фурман, говорит сама за себя. До 1989 года оставалось всего несколько месяцев.

Начало перестройки в 1986 году стало для Фурмана приятной неожиданностью. В далеком будущем он всегда ожидал пути к демократии в Советском Союзе, если он должен пройти через фазу правой реакции в «дряблом фашизме», поэтому он был рад, что страна выглядела так, как будто он будет избавлен от этого и сможет двигаться к упорядоченной либерализации быстрее и безболезненно, чем он когда-либо думал.Политические изменения того времени не отвлекли его от сравнительного изучения религии — его работы по индуизму, иудаизму и православию датируются 1988-89 гг. — но теперь он применил на них концептуальные инструменты, которые он разработал для их изучения. На кону стояла роль КПСС и ее идеологии в будущем России. Марксизм был научной теорией, подверженной эмпирическому контролю, как и любая другая, которая стала объектом веры, из-за которой люди умирали и убивали в масштабах, сопоставимых с христианством или исламом.С самого начала оно имело религиозное измерение, поскольку титаническая научная работа Маркса была совершена не только ради познания истины, но и для нахождения окончательного смысла жизни и истории, который скрывала религия. В своем сочетании пророческой страсти и энциклопедических амбиций Маркс и Энгельс были по своей природе — как и основатели всех основных религий — нонконформистами. Но, как и в случае с любой другой инновационной системой верований, в следующем поколении творческое вдохновение сменилось догматизацией.

На Западе это было относительно умеренно и быстро разрушалось. Однако в России нищета масс, тирания самодержавия, духовный вакуум, оставленный Православием, усилили догматизацию до предела, превратив революционную эсхатологию в железную партийную дисциплину, а эволюция от раннего марксизма к Сталину напоминала эволюцию примитивного христианства. Ивану IV. Если процесс шел намного быстрее, причина заключалась в скорости, с которой убеждения небольшого меньшинства становились верованиями всего народа.Революционный марксизм отвечал мыслям и чаяниям масс, потерявших веру в божественную справедливость и воскресение, ненавидевших своих угнетателей и мечтавших о небесах на земле. Их новые убеждения дали им силы совершать немыслимое и причинять невыносимое. Понимал их Платонов: это жители села Чевенгур . Сакрализация Ленина спонтанно возникла на той почве, на которой Сталин мог легко воздвигнуть свой культ.

Но в отличие от христианства, ислама или буддизма, которые существовали веками, эта религия исчезла очень быстро — потому что она никогда не была просто религией.Марксизм как наука взорвал марксизм как веру: субъективно, как только его предсказания коммунизма не сбылись, и два доступных защитных механизма «отсрочка» или «рай наступил» истощились и объективно по мере огромных социальных изменений его результаты — урбанизация, образование, индустриализация — преобразовали Россию, вытеснив полуграмотных фанатиков горького героизма Платонова. Мученики и палачи больше не понадобились. На смену пришли бюрократы и карьеристы. Институционализированная марксистская идеология превратилась в прочную оболочку вокруг внутреннего вакуума, в который просочился традиционный шовинизм великой державы при Сталине.Хрущев попытался возродить его реформами во имя Ленина, но импульс был слабым и вскоре иссяк. После 1968 г. его перерождение завершилось. Перестройка была попыткой продолжить линию реформ, в очередной раз прерванную в 1960-х, в чем-то вроде ленинской версии Второго Ватиканского Собора. Но он столкнулся с большими трудностями и опасностями.

Фурман утверждал, что необходимо срочно очистить авгиевы конюшни от этой догматической идеологии, но сейчас это малоинтересно: было легче отбросить это как ерунду.Но марксизм был не просто набором устаревших ответов на самые разные проблемы — он оставался набором вопросов, в некотором смысле имманентных современному человечеству. Подобно тому, как идеи, происходящие из христианства, сохраняют свое значение независимо от их мифологической формулировки (не Адам и Ева, но определенно несовершенство человеческой природы), так и глубокая потребность современного человека в исследовании логики и стадиальности всемирно-исторических процессов — где мы пришли из; куда мы идем — сохраняется, несмотря на канонизацию «пяти способов производства».Так что обобществление средств производства могло и не привести ни к чему хорошему, и русские теперь мечтали только об импорте капитализма. Но люди не могут перестать стремиться к социальному порядку, в котором они больше не подчиняются нечеловеческим потребностям общества, вкладывающего их как вторую природу, и не могут пытаться связать эти усилия с пониманием логики мировой истории. .

Даже в политическом плане была причина не просто отказаться от догм советской системы, а проанализировать их и извлечь из них рациональное ядро, опасаясь повторения того, что они представляли, — не для возврата к сталинизму, а для принятия противоположных идеологий, рожденных неспособностью выносить беспорядок, который может принести свобода от него.Как показала роль протестантизма в христианстве, для устойчивого развития общества реформированная вера была лучше, чем вера разрушенная. Идеологии могут играть разные роли на разных этапах своей истории. В эпоху Иоанна Павла II легко было забыть, что во времена его тотальной власти римское христианство было религией инквизиции и этнической чистки евреев и мавров из Испании. Точно так же в России то, что было идеологией ГУЛАГа, могло также стать инструментом демократизации, возрождение которого могло быть единственным способом гарантировать, что не будет новых ГУЛАГов.Но для того, чтобы снова обрести жизнь, ему пришлось бы подвергнуться критике на основе корня и ветвей.

Эссе «Сталин и мы с религиозной точки зрения», в котором эти размышления появились в 1989 году, было первым политическим вмешательством Фурмана. До этого он приветствовал перестройку, но без активного участия в общественной жизни. Чувство вины за его квиетизм теперь подтолкнуло его к этому. Но он оставался тем книжным гуманистом, каким был раньше, чья пассивность была также определенным отрывом от окружающих его политических реалий.Как он позже заметил, после того, как он всегда меньше всего интересовался этим, «я начал отдавать должное марксизму, когда все уже перестали им заниматься». Это изменение было вызвано надеждами, вызванными Горбачевым. Но, как он отметил в том же ретроспективе, перестройка — «запоздалый советский вариант Пражской весны» — наступила слишком поздно. Перспектива эволюционной демократизации СССР через марксистскую реформу «требовала некоторого минимального количества людей, способных воспринимать эти идеи буквально, а не как прикрытие или внешнюю форму.Таких людей в 1960-е было много; в 1980-х их не было ». Среди его современников те, кто когда-то — приверженцы или любители — придерживался научного социализма, погружались в оргии восхищения капитализмом. Это не было зрелищем, которое побудило его отказаться от жизненного плана работы в области сравнительного религиоведения. Он писал грамматические комментарии на санскрите к своей рукописной копии Бхагавад Гиты , когда перестройка рухнула в результате переворота 1991 года.

После веселого вечера в доме Фурмана, где он ночевал, Алексей Панкин утром 19 августа разбудил друга со словами «Взяли Горбачева», прежде чем Панкин до конца понял, что произошло. Фурман сказал ему, что все кончено: кто бы ни победил, демократия уже потеряна. Независимо от того, окажутся ли победителями Государственный комитет по чрезвычайному положению или Ельцин и его сторонники, они будут подавлять оппозицию и удерживаться у власти любой ценой. Это был поворотный момент для Фурмана.С этого момента из чувства гражданского долга он с усилием воли перешел от сравнительной религии к современной политике. В течение следующих двадцати лет он много писал о политической сцене в России. Подборка его статей, опубликованных в двух книгах, разделенных десятилетием, занимает тысячу страниц. Это были «анализы на бегу», как он их называл, со всеми ловушками эфемерного комментария текущих событий, которые можно найти в журналистике Маркса и Энгельса или Парето, в отличие от их теоретической работы.Такое вмешательство должно быть беспристрастным, объективным и дальновидным. Но это было трудно, заметил он, когда на кону стояла судьба вашей страны, вас самих и ваших друзей.

В эпоху Ельцина, как он позже признался, Фурман почувствовал отвращение к новым правителям страны. Для самого Ельцина, которого он считал морально и интеллектуально патологической фигурой, он чувствовал только страх и отвращение; а для интеллигенции, которая его боготворила — его собственный слой — отвращение к их оппортунизму.Они напали на Горбачева, который их освободил, «как собаки, сидящие в клетке и нытье, пока их не выпустил тот, на кого они немедленно напали». Большинство из них были членами партии, и это была их революция. «Наконец-то настало время для нашего поколения» — 40-летних, — сказал ему знакомый, и это было правдой. В России, в отличие от Восточной Европы, молодежь не принимала активного участия в ниспровержении СССР или в том, что за этим последовало: явно отсутствовало присутствие студентов. Все это были частные мнения, которые он высказал спустя много времени.В то время его публичные выступления были достаточно резкими, но их тон, как правило, был спокойным и задумчивым: ad rem , а не ad hominem . С ними он занял странную позицию в российских СМИ: с ним соглашались очень немногие, но никому не хотелось с ним связываться. Его взгляды, изолированные в тревожном отношении, были постоянным оскорблением общепринятого мнения того периода.

Вердикт, который Фурман немедленно вынес по поводу переворота в августе 1991 года, определил ключ к тому, что должно было произойти: «Победа демократов — это поражение демократии.«То, как Ельцин и его последователи пришли к власти, обеспечили сохранение авторитарного режима. Снова произошел переворот меньшинства, который, как и в 1917 году, заставит его авторов задраить люки, чтобы держаться за свою власть, обещая при этом более светлое будущее массам. Русский либерализм не пользовался популярностью, в отличие от русского национализма, и Ельцин без колебаний использовал его против Горбачева, чтобы проложить себе путь в Кремль. Насколько мало он и его группа заботились о средствах укрепления своей власти, сразу же продемонстрировала сделка в Беловежском лесу, в результате которой был распущен СССР, даже без претензий на всенародное обсуждение в России, где она, несомненно, была бы отклонена.Когда они столкнулись с оппозицией в избранном законодательном собрании, эти демократы, не колеблясь, — как и путчисты 1991 года — пролили кровь, чтобы сокрушить его, обстреляв парламент танками и вызвав гораздо больше смертей, чем публично признавали; ни фальсифицировать результаты референдума, которым они затем протаранили конституцию для президентского автократа. Как и их предшественники, эти люди считали допустимым подавление демократии сейчас, чтобы построить лучшую демократию в будущем.

Идеология, которую они приняли в своем названии, была не более чем грубой инверсией исторического материализма, который они осуждали, принятием коммунистического образа Запада и изменением его ценностных знаков. Частная собственность и рынок были кладезем всего хорошего. Основой демократии может быть только класс собственников, поэтому, если буржуазный слой можно будет вырвать, передав национальные активы вульпийскому меньшинству, будет открыт путь к абсолютной свободе и богатству для всех.В этом перевернутом мире Столыпина романтизировали как героя капиталистического пути к демократии, в то время как меньшевики ниспровергали демократию, борясь против капитализма, а Пиночет был лучшим архитектором свободы, чем Альенде. Ни в одном другом посткоммунистическом обществе «интеллектуальный капитализм» не получил такого влияния, как в стране, наименее подготовленной в культурном и психологическом отношении к капиталистическому рынку.

На самом деле, заметил Фурман, капитализм добился успеха только там, где в него были вплетены докапиталистические традиции: протестантское сознание в Англо-Америке, феодальные концепции лояльности и долга в Японии, конфуцианская мораль на Тайване или в Китае.В России сопоставимыми ресурсами было бы отношение крестьянина к социалистическому чувству достоинства труда и престижа высокого уровня науки и образования, воспитанные в СССР. Но они были полностью растрачены режимом, в котором доминировали интеллектуалы, отбросившие лучшее наследие марксизма, и бюрократы, которые отвергали любую его реформацию как возврат к раннему большевистскому аскетизму, предпочитая вместо этого погрязнуть в собственном обогащении. Так что не тяжелая работа или предприимчивость, а мошенничество и воровство получили идеологическую санкцию, подтверждающую популярные карикатуры на капитализм и буржуазную демократию с советских времен.Результатом стал полностью криминализированный капитализм, мафиозные банды которого, массовое разочарование и антидемократические настроения, вероятно, переживут сам режим. Это был третий раз в нашей истории, сказал Фурман своим соотечественникам, что мы думали, понимая, что мы считаем «ключом» к западному успеху, радикально порвать с прошлым, только чтобы сохранить его худшие черты. Каждый раз мы ошибались. Рынок был лишь одним из аспектов, а не основой современного общества, которое требовало верховенства закона, неотделимого от демократии, и богатства, создаваемого честным и творческим трудом.Изречение перестройщика было правильным: «Как работаем, так и будем жить».

Начало правления Ельцина соответствовало предсказаниям Фурмана. Тем не менее, оглядываясь назад, он мог сказать, что к концу десятилетия он чувствовал меньше страха, чем облегчения, поскольку худшего — насильственного распада, подобного распаду Югославии, — удалось избежать. Националистическая реакция на распад СССР и империалистическую трансформацию правящей элиты оказалась слабее, чем можно было представить.Опасаясь этого, он недооценил два фактора: зависимость верхнего слоя режима от Запада и рефлекторное подчинение российских масс власти. Оба участвовали в мошенническом переизбрании Ельцина в 1996 году, приветствовались на Западе, но также были приняты обычными людьми, несмотря на острое социальное недовольство и широко распространенную неприязнь к нему. Парадоксально, но популярная ностальгия по стабильности позднесоветского общества на самом деле помогла Ельцину, который его разрушил. Для масс в России 1990-х уже было достаточно хаоса: страх смены власти оказался больше, чем гнев против власти.Сильный человек, каким бы дискредитированным он ни был, был предпочтительнее риска не иметь его. Вопреки широко распространенному мнению и собственному желанию Фурман никогда не сомневался, что Ельцин останется в Кремле.

Было ли все это неизбежным? Размышляя об этом, Фурман развил идею, на которую намекали его размышления о выборе Владимиром православия в Киеве. В истории были определенные моменты, когда открывался веер возможностей, допускающих совершенно разные результаты. Это были нечастые и часто короткие конъюнктуры, прежде чем щелкнул вентилятор.Приход Горбачева был одним из них. СССР мог продолжаться в упадке в течение двадцати лет или подвергнуться внезапному распаду и повороту вправо, как иногда предполагал Фурман. Курс Горбачева был наименее вероятным из сценариев, счастливым подарком истории, который был «своего рода выигрышем в лотерею». Как такая фигура вообще могла подняться на вершину КПСС во времена Брежнева? Ответ, безусловно, отчасти кроется в его провинциальном прошлом. Он прибыл в коррумпированную и светскую столицу Москву очень поздно, только в 1978 году, сохранив свежесть и наивность своего происхождения.В этом ему, должно быть, помогли его простота и искренность, потому что они были настолько редки в то время — немыслимо для московской интеллигенции, но ценились циничными партийными старейшинами, напоминая им об их молодости и, возможно, намекая, что они, в конце концов, служили великим людям. причина. Чего они не могли понять — никто не мог — так это его храбрости и смелости его амбиций, когда власть перешла к нему по биологической причине. Марксистская реформация стремилась освободить советское общество из бюрократического тюремного заключения.Горбачев был не первым правителем в России, который стремился использовать свою власть на благо страны и ее народа. Его величие заключалось в его готовности ограничить его ради их блага и рискнуть потерять его, а не отказаться от своих принципов. В этом он был исторически уникален. Он был коммунистом, который добровольно — без принуждения — уменьшил свою власть, предпочитая компромисс диктату.

Простодушие не покидало его, когда он оккупировал Кремль, и всегда было ограничением.У него не было реального плана перестройки, только серия изображений того, что он хотел бы увидеть или сделать. Он плохо разбирался в людях, слишком доверял другим, большинство из которых предали бы его. Вдобавок он создал две референтные группы, которые могли только навредить его предприятию. Первой была интеллигенция, которую Горбачев переоценивал из-за большого уважения к культуре и осознания собственной скромности, но меньше всего имела время для его социалистических идеалов. Вторым был Запад, чей энтузиазм по отношению к нему отвлекал его внимание от домашних проблем и чьи советы он воспринимал слишком серьезно.Оба подорвали его уверенность в поставленных целях. К концу, когда его вера в них пошла на убыль, у Тэтчер появились более сильные убеждения, чем у него.

Пожалуй, наиболее критичным было его переоценка «здравого смысла» каждого, в том числе русского народа. Он сказал, что самое важное в политике — это «измерить», но он постоянно воспринимал присутствие этого качества в других как должное. Он не мог заставить себя понять, что от людей, только что освободившихся из тоталитарного заключения, нельзя ожидать, что они будут действовать нормально и разумно.Через пару лет им было предоставлено столько свободы, сколько они могли. Они не были готовы к большему, но Горбачев продолжал настаивать. Ибо как правитель он сохранил ленинскую веру в творчество масс и ленинскую поспешность в своих действиях. История слишком долго откладывала создание Горбачева, но затем он бросился слишком быстро, ускоряя динамику, которую он привел в движение, даже когда ей требовалось торможение. Когда наступил кризис 1988-89 годов, он все еще пытался разрешить его путем переговоров и переговоров, пытаясь урезонить оппонентов, которые видели в его подходах простую слабость.Полагаться на здравый смысл всех заинтересованных сторон — значит хвататься за соломинку. Тогда великодушие превратилось в самообман. Если бы он действовал решительно против тех, кто стремится его свергнуть, он сохранил бы поддержку народа и мог бы избежать фиаско 1991 года, когда, если бы Горбачев объявил исключительную ситуацию, Фурман поддержал бы его. И все же достоинство, с которым он перенес свое падение, было признаком того же характера. В конце концов, его неудача не была личной: социальных сил, необходимых для проведения перестройки, больше не было.

Скрининг и оптимизация в масштабе микропакетов

Цитирование: Zang Y, Kammerer B, Eisenkolb M, Lohr K, Kiefer H (2011) К кристаллизации белка как шагу процесса последующей обработки терапевтических антител: скрининг и оптимизация в Microbatch Шкала. PLoS ONE 6 (9): e25282. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025282

Редактор: Сью Коттерилл, Лондонский университет Св. Георгия, Великобритания

Поступила: 22 марта 2011 г .; Одобрена: 31 августа 2011 г .; Опубликовано: 22 сентября 2011 г.

Авторские права: © 2011 Zang et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта программа поддерживается BMBF (Федеральное министерство образования и исследований Германии), грант №. 0315338A (http://www.bmbf.de/en/index.php) и Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Биберах, Германия (http://www.boehringer-ingelheim.де /). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: KL работает в компании Boehringer Ingelheim GmbH, которая предоставила материал (антитело mAb04c) и небольшую часть финансовой поддержки (<15%) для этого проекта. Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLoS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Терапевтические моноклональные антитела (mAb) были введены на рынок в 1986 году.С тех пор технологии обработки для этого класса терапевтических средств достигли огромного прогресса, о чем свидетельствуют рекомбинантные клеточные линии, дающие титры в диапазоне 10 граммов на литр клеточной культуры. Технология последующей обработки в настоящее время в значительной степени зависит от хроматографии протеина А, быстрой и высокоселективной стадии улавливания, за которой следуют дополнительные хроматографические процедуры, такие как ионообменная хроматография или хроматография гидрофобного взаимодействия. Хотя чистота mAb, достигаемая после хроматографии на протеине A, обычно превышает 90%, требуются дополнительные стадии очистки для достижения целей исключительно высокой чистоты биофармацевтических препаратов.Основным недостатком хроматографических процедур является высокая стоимость адсорбционной среды, которая может составлять более десяти тысяч долларов США за литр смолы с протеином А. Следовательно, более экономичные процедуры, способные заменить хотя бы одну хроматографическую операцию, являются предметом обширных исследований.

Кристаллизация белка, которая в основном применяется при анализе структуры белка, в принципе признана методом очистки белка [1], [2]. Внутри кристалла белковые молекулы образуют регулярную решетку, способную исключать другие белки, а также неправильно свернутые белковые молекулы того же типа.Таким образом, кристаллизация, обычно применяемая к небольшим молекулам, также может использоваться в качестве дешевой и масштабируемой процедуры очистки [3]. Более ранняя работа продемонстрировала возможность очистки белка путем кристаллизации, например. для промышленной липазы [4] или модельного белка овальбумина [5]. Однако единственный биофармацевтический препарат, обычно кристаллизующийся в промышленных масштабах и с отличным выходом при извлечении, — это инсулин [6]. Инсулин — это небольшой и необычайно стабильный пептид, способный легко преобразовываться в свою природную структуру даже после воздействия органических растворителей.Он кристаллизируется на поздней стадии очистки, когда большая часть примесей уже удалена [4].

Дополнительными преимуществами кристаллизации белка с точки зрения рецептуры являются более высокая стабильность кристаллических белков по сравнению с белковыми растворами, что делает кристаллические составы привлекательной альтернативой с потенциально более длительным сроком хранения, а также возможность контролировать доставку белка с помощью растворения кристаллов. кинетика [7]. Последний широко исследовался в контексте составов инсулина [8].

Для иммуноглобулина использование этого метода в качестве средства очистки или составления рецептур еще не является рутинной процедурой. Несколько авторов изучали фазовое поведение mAb с целью определения рационального подхода, ведущего к условиям кристаллизации [9] — [11]. Работа осложняется тем фактом, что помимо кристаллизации могут происходить другие явления, такие как осаждение, разделение фаз и образование гелеобразных фаз, которые кинетически захватывают систему далеко от равновесия и, как следствие, снижают выход кристаллического белка или полностью подавить образование кристаллов.

В нашем исследовании мы выбрали mAb IgG4, которое легко кристаллизуется в ряде условий, что позволяет нам оптимизировать процедуру в отношении восстановления массы и активности и степени чистоты. Сосредоточившись на простой системе, состоящей из растворителя и кристаллов, мы смогли определить предел растворимости на фазовой диаграмме и использовать его в качестве отправной точки для увеличения масштаба до стадии процесса, соответствующей требованиям GMP. Цель этой работы — показать, как можно улучшить и оптимизировать начальные условия кристаллизации, чтобы получить стадию процесса, обеспечивающую высокую чистоту и высокое извлечение.Однако мы хотим отметить, что для любого индивидуального антитела эти начальные условия должны быть определены путем скрининга. Пока не существует метода, который позволял бы прогнозировать условия кристаллизации на основе последовательности белка или общих физико-химических параметров. Условия кристаллизации также не могут быть перенесены с одного белка на другой, даже если они очень тесно связаны в последовательности [12]. Осмотический вириальный коэффициент B ₂₂ , который, как было показано, часто принимает значения в пределах определенного диапазона («щель кристаллизации») в условиях, способствующих кристаллизации белка [13], не оказался общим предиктором для белков, трудно кристаллизующихся [13]. 10] [14].

Материалы и методы

Антитело

Осветленный супернатант клеточной культуры производной линии СНО, секретирующей моноклональное антитело типа IgG4 mAb04c, а также mAb04c, очищенное от протеина A, были любезно предоставлены Boehringer Ingelheim Pharma GmbH (Биберах, Германия).

Техника кристаллизации

Wizard ™ I, II, III Crystal Screen были получены от Emerald BioSystems (остров Бейнбридж, США). Базовый и дополнительный комплекты были от Sigma (Тауфкирхен, Германия).

Для кристаллизации белка использовались как методы диффузии пара, так и микропакеты. Методы выполнены по Бергфорсу [15]. 96-луночные планшеты для кристаллизации от Corning (Амстердам, Нидерланды) и Crystalbridge ™ (45 мкл) от Greiner bio-one (Германия) использовали для сидячих капель. Планшет с 24 лунками (Greiner bio-one) использовали для висячей капли и планшет с 60 лунками (Greiner bio-one) для кристаллизации микропартий. Перед кристаллизацией белковый раствор фильтровали через фильтр 0,2 мкм (Sartorius, Германия).

Концентрация и замена буфера

mAb, очищенное белком A, диализовали в течение ночи против 20 мМ Трис-буфера pH 7,0 при 4 ° C, а затем концентрировали до желаемой концентрации с помощью центробежного фильтра Vivaspin ™ 500 (30 кДа MWCO, Sartorius) центрифугированием (15000 g, 4 ° C). C). Супернатант клеточной культуры подвергали диафильтрации с использованием 7 объемов мембранных кассет с 20 мМ Трис, 50 ​​мМ гистидина, pH 7 и 30 кДа MWCO (Hydrostat, Sartorius, Германия). Затем mAb концентрировали с помощью Vivaspin ™ 500 до необходимой концентрации.

Концентрацию очищенного mAb определяли фотометрически при 280 нм с использованием фотометра NanoDrop® 1000 (Thermo Scientific, США), тогда как концентрацию mAb в супернатанте культуры измеряли методом эксклюзионной ВЭЖХ (SE-HPLC) на колонке Tosoh TSK-GEL 3000 SWXL. при 25 ° C. Система ВЭЖХ — HP1100 от Agilent (Вальдбронн, Германия). Буфер для элюирования — 0,05 М Трис / 0,15 М NaCl, pH 7, скорость потока — 1 мл / мин. Для записи хроматограмм использовалось программное обеспечение Chromeleon® (Dionex, Саннивейл, США).Белок детектировали при 225 нм, и интегрированные пики элюирования сравнивали со стандартной калибровочной кривой mAb.

Чистоту mAb оценивали с помощью SE-HPLC и SDS-PAGE на 12,5% гелях Laemmli. Гели SDS окрашивали кумасси синим или серебром.

Различие кристаллов и аморфного осадка

Кристаллы и аморфный осадок выделяли по двойному лучепреломлению с помощью микроскопа (Nikon Eclipse 80i, Дюссельдорф, Германия), снабженного поляризационными фильтрами.Кристаллы двулучепреломляющего белка меняют цвет при вращении поляризационного фильтра, в то время как аморфный осадок не проявляет такого поведения.

Сбор белковых кристаллов

Кристаллы отделяли от маточного раствора путем 10-минутного центрифугирования при 4 ° C и 10000 g и промывали 3 раза резервуарным раствором, причем каждый объем промывного резервуара был таким же, как и у исходного образца суспензии кристаллов. Кристаллы повторно растворяли в 100 мМ ацетате натрия, pH 4,0, и хранили при 4 ° C для дальнейшего анализа.

Определение фазовой диаграммы

Кажущаяся фазовая диаграмма была получена в результате экспериментов с микропакетами в 60-луночных планшетах при комнатной температуре (около 22 ° C). 1,5 мкл раствора белка смешивали с эквивалентным объемом реагента для кристаллизации и покрывали парафиновым маслом (Hampton Research, Aliso Viejo, США). Эксперименты контролировали визуально под микроскопом в течение пяти дней. Начиная с третьего дня визуальных изменений не обнаружено.

В метастабильной зоне самопроизвольного зародышеобразования не происходит, и поэтому равновесие не может быть достигнуто за счет роста кристаллов из пересыщенного раствора.Поэтому предел растворимости мАт04с измеряли путем растворения кристаллов в растворе, не содержащем белков, до достижения равновесия. MAb04 сначала кристаллизовали под контролем микроскопии при 8 мг / мл белка, 8% мас. / Об. PEG 8000, 0,2 M Ca (OAc) ₂ , 0,1 M имидазол, pH 7, используя микропериодический процесс. Кристаллы собирали, гомогенизировали с помощью Seed Bead ™ (Hampton Research) и ресуспендировали в деионизированной воде. Аликвоты по 20 мкл этой суспензии добавляли в центрифужные пробирки на 1,5 мл. Затем к каждой аликвоте добавляли 100 мкл раствора осадителя, как указано выше, но с различными концентрациями PEG 8000.Количество кристаллизованного белка было избыточным, так что кристаллы не могли раствориться полностью. После пяти дней перемешивания в термомиксере Campact (RT, 300 об / мин, Eppendorf, Германия) концентрацию белка в супернатанте определяли с помощью измерения A ₂₈₀ на фотометре NanoDrop после 10-минутного центрифугирования при 10000 g. Контрольные эксперименты показали, что в это время было достигнуто равновесие.

Измерение активности связывания

Функциональную целостность Fc-части кристаллизованного mAb подтверждали связыванием с иммобилизованным белком A на приборе Biacore® T100 SPR (GE Healthcare, Германия), как описано производителем.

Пиковые эксперименты с белками, ДНК и бактериофагами

Белки клетки-хозяина (HCP), вирусы и ДНК являются критическими примесями при производстве биофармацевтических препаратов. Поэтому были проведены эксперименты по добавлению модельных белковых примесей, геномной ДНК и бактериофага Т7 в качестве модели вируса.

Для добавления HCP очищенное mAb (8,6 мг / мл) смешивали с лизоцимом (14,3 кДа, 10 мг / мл, Fluka, Швейцария) или BSA (бычий сывороточный альбумин, 66 кДа, 10 мг / мл, Carl Roth, Германия). а затем кристаллизовался диффузией пара в сидячей капле.Осаждающий раствор представлял собой 10% мас. / Об. PEG 8000, 0,2 M Ca (OAc) ₂ , 0,1 M имидазол, pH 7, как указано выше.

Для добавления ДНК и фага к мАт04c добавляли ДНК в концентрации 25 мкг ДНК / мг мАт или фаг в концентрации 6,4 × 10 ⁷ БОЕ (единица образования бляшек) / мг мАт. Кристаллизацию проводили, как указано выше.

Bacteriophage T7 и E. coli штамм B были любезно предоставлены A. Kuhn (Университет Хоэнхайма, Германия). Концентрацию бактериофага определяли путем подсчета бляшек в соответствии с онлайн-протоколом [16]. E. coli культивировали в среде LB, pH 7,5. Фаг разбавляли 0,85% фосфатно-солевым буфером (буфер PBS: 8 г / л NaCl, 0,2 г / л KCl, 1,44 г / л Na ₂ HPO ₄ , 0,24 KH ₂ PO ₄ , pH 7,4 ). Чашки с агаром содержали 20 г пептона, 3,5 г NaCl, 15 г агара, 1,5% (мас. / Об.) Глюкозы, 6,75 мМ Na ₂ HPO ₄ , 8 мл 1% -ного анилинового синего (отфильтрованного через стерильный фильтр 0,2 мкм) за литр. Агар с мягким верхом содержал 7 г агара на литр. Все растворы автоклавировали.

измеряли с помощью 96-луночного микропланшета (Greiner bio-one) для анализа SYBR® Green I (Invitrogen, Германия) [17]. Хромосомная ДНК была из спермы лосося (Fluka, Германия). Считывающее устройство для микропланшетов SpectraMax® было от Molecular Devices (США). Возбуждение: 488 нм / Эмиссия: 520 нм.

Результаты и обсуждение

Семь попаданий (микрокристаллы или кристаллы) были обнаружены при скрининге разреженной матрицы с использованием коммерческих наборов для просеивания. После 3-х повторных тестов с 7 найденными условиями наиболее устойчивое состояние (10% мас. / Об. PEG 8000, 0.2 M Ca (OAc) ₂ , 0,1 M имидазол, pH 7) был выбран в качестве отправной точки фазовой диаграммы. Полученные кристаллы имели форму гроба (рис. 1). Механическая жесткость, качественно оцененная микроманипуляциями с использованием «Crystal tools» (Hampton Research) под микроскопом, была высокой по сравнению с «иглами», обнаруженными в других скрининговых экспериментах. Когда был приготовлен посевной материал (см. Выше), без «бисера», действующего как шаровая мельница, даже сильное встряхивание привело к получению препарата, который содержал относительно крупные кристаллы и фрагменты.Поэтому мы ожидаем, что эти кристаллы не будут сильно фрагментироваться под действием механического напряжения, например в кристаллизаторе с перемешиванием и будет подходящим для последующего разделения твердой и жидкой фаз. Растворимость белка изучалась как функция концентраций белка и ПЭГ 8000 в 0,1 М имидазоле 0,2 М ацетате кальция pH 7 при комнатной температуре (фиг. 2). Растворимость mAb снижалась с увеличением концентрации осадка. Кристаллы наблюдались при концентрациях ПЭГ 8000, превышающих 5% (мас. / Об.). В диапазоне концентраций белка от 10 до 14 мг / мл имелась широкая область кристаллизации от 5 до 9% PEG 8000.

Рис. 1. Микрофотография кристаллов mAb04c в поляризованном свете.

3 мкл микропакет. Условия: 1,5 мкл 20 мг / мл мАт04c в 20 мМ Трис, 50 ​​мМ гистидина, pH 7 плюс 1,5 мкл 12% (мас. / Об.) PEG 8000, 0,4 М ацетата кальция в 0,2 М имидазола, pH 7, КТ. Разбитый кристалл (намеренно) указывает на то, что размер кристалла составляет примерно 100 ~ 150 мкм × 10 ~ 20 мкм × 10 ~ 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025282.g001

Однако этот метод не обеспечивает предела растворимости, поскольку кристаллизация не происходит спонтанно в метастабильной области, где кинетические эффекты предотвращают зародышеобразование [12].Поэтому предел растворимости определяли путем приготовления насыщенных растворов, находящихся в равновесии с кристаллическим белком, и измерения концентрации белка в супернатанте. Было обнаружено, что предел растворимости (сплошная линия на рисунке 2) расположен далеко от зоны кристаллизации при концентрациях белка и осадителя, по крайней мере, на один порядок ниже предела спонтанной кристаллизации. Этот результат указывает на то, что mAb04c кристаллизуется спонтанно только при сильном перенасыщении.

Кристаллизацию mAb04c в присутствии контаминирующего белка исследовали путем добавления примесей модельного белка, как описано Judge et al [5]. Кристаллы появлялись через 2 дня, и форма кристаллов была неотличима от кристаллов незагрязненного мАт04с. Кристаллы собирали через 5 дней и затем повторно растворяли в 100 мМ ацетата натрия, pH 4. При SDS-PAGE ни лизоцим, ни BSA, все еще присутствующие в маточном растворе, не были обнаружены в повторно растворенных кристаллах mAb (фиг. 3, дорожки 3 и 6).Единственные обнаруживаемые полосы являются результатом исходного белка mAb (легкая и тяжелая цепи IgG), плюс полоса, вероятно, является результатом частично разрушенной тяжелой цепи. Загрязняющие вещества лизоцим и BSA присутствовали только в маточном растворе (дорожки 2 и 5) и в промывных растворах (дорожки 4 и 7). Сообщается, что окрашивание серебром выявляет отдельные полосы, превышающие 10 нанограмм, что указывает на то, что было удалено более 90% белковых загрязнений.

Рис. 3. SDS-PAGE эксперимента по добавлению HCP.

Морилка. Дорожки: (1) мАт04с, стандарт; (2) маточный раствор с мАт04с и лизоцимом; (3) кристаллы mAb04c, промытые лизоцимом из маточного раствора; (4) супернатант от кристаллизации лизоцимом; (5) маточный раствор с мАт04с и БСА; (6) промытые кристаллы mAb04c из маточного раствора с BSA; (7) супернатант от кристаллизации с BSA.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025282.g003

Успешно проведя тест на добавление HCP, мы попытались очистить mAb04c из культурального супернатанта посредством одностадийной кристаллизации.Супернатант кондиционировали и концентрировали диафильтрацией / ультрафильтрацией и центрифугированием, как описано выше. Объем суспензии для кристаллизации увеличивали с 2 мкл до 40 мкл в Crystalbridge ™ (20 мкл раствора белка плюс 20 мкл резервуара). Резервуар также был увеличен до 20 мл, чтобы соотношение оставалось постоянным.

Подобно результатам теста на добавку HCP, кристаллы стали видимыми через 2 дня (рис. 4). Через 5 дней собранные кристаллы повторно растворяли в 20 мкл 100 мМ ацетата натрия, pH 4.На SDS-PAGE с окрашиванием кумасси (фиг. 5) концентрация загрязняющих белков была значительно снижена (дорожка 2). Образец IgG, очищенный хроматографией на протеине А, показан в качестве эталона (дорожка 3). Затем чистоту и количество mAb в каждой фракции оценивали с помощью HPLC-SEC (таблица 1). Перед кристаллизацией чистота mAb04c в растворе (8,3 мг / мл в 20 мкл супернатанта) составляла 42% от общего белка в соответствии с интеграцией пиков. Анализ повторно растворенных кристаллов (2,6 мг / мл mAb в 20 мкл буфера) показал, что в результате кристаллизации не образовывался значительный олигомер (фиг. 6).Чистота была значительно увеличена до 90% от общего белка. Тем не менее, только 31,3% mAb, первоначально присутствовавшего в супернатанте культуры, было извлечено в кристаллы, в то время как большая часть (67,5%) все еще была обнаружена в супернатанте кристаллизации. Для сравнения, выход кристаллического mAb04c, прошедшего предварительную очистку от протеина A, составлял 95% без детектируемого продукта в маточном растворе.

Рис. 4. Микрофотография кристаллического мАт04c, кристаллизовавшегося из осветленного культурального супернатанта.

Состояние кристаллизации: сидячая капля. Резервуар: 0,1 М имидазол, 0,2 М ацетат кальция, 9% мас. / Об. ПЭГ 8000. 20 мкл осветленного культурального супернатанта (8,3 мг / мл мАт04с) плюс резервуар 20 мкл, RT. Шкала 100 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025282.g004

Рис. 5. Не восстанавливающий SDS-PAGE mAb04c, окрашенный кумасси синим, до и после кристаллизации или очистки протеина A.

7 мкг IgG загружали на дорожку. Дорожки: (1) супернатант осветленной культуры мАт04с; (2) промытые кристаллы mAb04c, повторно растворенные в 100 мМ ацетате натрия, pH 4.0; (3) мАт04с, очищенное с помощью хроматографии на протеине А.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025282.g005

Рис. 6. SE-хроматограмма образца до и после кристаллизации.

Буфер для элюции: 0,05 М Трис / 0,15 М NaCl, pH 7; скорость потока: 1 мл / мин; длина волны: 225 нм. (А) Осветленный супернатант культуры мАт04с. Пик 3: mAb04c, 8,42 мин; Пик 4: загрязняющий белок, 9,98 мин; Пик 5: гистидин в буфере, 12,19 мин. (B) промытые кристаллы mAb04c, повторно растворенные в 100 мМ ацетате натрия, pH 4.0. Пик 2: mAb04c, 8,43 мин.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025282.g006

Связывающую способность mAb04c с протеином A до и после кристаллизации определяли с помощью Biacore®. Константы скорости ассоциации (k _a ) сравнивали для оценки потенциальной потери аффинности. Перед кристаллизацией k _a было определено как 3,35 × 10 ⁶ л / (моль * с), а после кристаллизации k _a было 4,81 × 10 ⁶ л / (моль * с).По-видимому, кристаллизация не влияла на сродство Fc-области к белку A.

В экспериментах с добавлением пиков бактериофаг Т7 и хромосомная ДНК были добавлены к раствору mAb перед кристаллизацией, чтобы проверить способность процесса кристаллизации удалять небелковые примеси. Результаты суммированы в таблице 2. LRV (логарифмическое значение снижения) составляло 1,4 для ДНК и 2,2 для фага Т7.

В настоящей работе мы изучили возможность установления кристаллизации как стадии процесса для очистки и создания моноклональных антител.Высокие выходы были достигнуты, когда кристаллизация проводилась после хроматографической очистки, но не тогда, когда кондиционированный супернатант клеточной культуры использовался в качестве исходного материала. Интересно отметить, что кристаллизация из культурального супернатанта, тем не менее, была возможна и привела к эффективному удалению загрязняющих веществ.

Мы часто наблюдали, что в пределах области кристаллизации (область, обозначенная треугольниками на рисунке 2), белок первоначально выпадал в осадок сразу после смешивания (рисунок 7a), тогда как кристаллы обнаруживались под микроскопом только после периода задержки в 3–4 часа (рисунок 7b и 7в).Этот эффект известен из литературы. Даже когда кристаллическая форма белка более стабильна, чем его аморфная форма, медленное зародышеобразование может задерживать образование кристаллов по сравнению с аморфным осадком [18], [19]. Тогда концентрация осадка будет уменьшаться одновременно с ростом кристаллов. Были предложены две модели для объяснения роста кристаллов из преципитатов: фазовый переход и созревание Освальда [20]. Фазовый переход — это процесс, при котором кристаллы образуются за счет твердой аморфной фазы, тогда как созревание Освальда описывает рост нескольких кристаллов за счет множества микрокристаллов [21].Ng et al. [20] сообщили, что оба процесса могут происходить одновременно. К сожалению, описанный выше метод двойного лучепреломления не применим к микрокристаллам, размер которых меньше разрешающей способности микроскопа. Из-за отсутствия метода, позволяющего различать аморфный осадок и микрокристаллы, мы не могли решить, какой из перечисленных процессов является доминирующим.

Рис. 7. Динамика кристаллизации микропакетов.

Белок: 8 мг / мл mAb04c, буфер для кристаллизации: 8% (мас. / Об.) PEG 8000, 0.2 М ацетат кальция 0,1 М имидазол, pH 7,0, RT. Время после смешивания: (A) 0 часов, (B) 2 часа, (C) 10 часов, (D) 70 часов. Шкала 100 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025282.g007

Насколько нам известно, это первое определение предела растворимости в равновесии для белка IgG. Ахамед и др. [9] описывают кажущийся предел растворимости в системе, в которой выпадают в осадок, но не образуются кристаллы. По сравнению с их результатами мы обнаружили гораздо более низкий предел растворимости.Конечно, это можно объяснить использованием другого белка, но Ahamed et al. указывают на то, что они ожидали бы более низкого предела растворимости при равновесии, то есть в присутствии кристаллов, а не осаждения. Это же антитело исследовали Lewus et al. [10] недавно, и условия кристаллизации теперь были определены при другом pH. Однако здесь предел растворимости не был определен однозначно, поскольку концентрации, измеренные в супернатанте, уменьшались в течение 2 месяцев (рис.4 ссылки выше). Большой разрыв, обнаруженный в наших экспериментах между равновесной растворимостью и зоной спонтанной кристаллизации, на первый взгляд кажется неожиданным, но может быть особенностью IgG в целом. Однако подобные исследования других модельных систем антител необходимо будет провести, прежде чем эта точка зрения будет подтверждена. С практической точки зрения наш результат означает, что в непрерывном процессе с использованием гетерогенного зародышеобразования белок должен кристаллизоваться при гораздо более низкой концентрации белка, такой как 2 мг / мл, и при концентрациях осадителя 7% PEG 8000 или даже ниже.

Удаление протеиновых примесей и вирусов было успешным и сопоставимо с хроматографией на протеине А. Однако удаление ДНК было незначительным. Это может быть связано с адсорбцией ДНК на поверхность кристалла за счет электростатического взаимодействия (мАт04с положительно заряжен при pH кристаллизации). Мы обнаружили, что уменьшение пиковой концентрации до 2,5 мкг ДНК / мг mAb приводило к 0,35 мкг ДНК / мг mAb (данные не показаны), то есть к еще более низкому LRV.

Выход кристаллизованного mAb, прошедшего предварительную очистку от протеина A, достиг 95%.Это ожидается, когда условия кристаллизации намного превышают предел растворимости, показанный на фазовой диаграмме. Однако такие высокие урожаи не могли быть достигнуты, когда супернатант клеточной культуры подвергали кристаллизации. Здесь восстановление ~ 30% указывает на то, что либо растворимость mAb резко увеличилась из-за других соединений, присутствующих в супернатанте культуры, либо кристаллизация просто замедлилась. Микроскопическое исследование показало, что начало образования кристаллов значительно задерживалось, когда культуральный супернатант использовали вместо очищенного антитела: в последнем случае кристаллы можно было обнаружить уже через 10 часов, тогда как тот же процесс занимал 48 часов, начиная с культурального супернатанта.Тем не менее формы кристаллов в обоих случаях были похожи.

Значительное зародышеобразование является основным требованием для образования кристаллов. Скорость зародышеобразования в принципе зависит от растворимости белка, степени перенасыщения и межфазной свободной энергии (γ) между растворенным веществом и раствором [22]. На первые два вклада не ожидается существенного влияния примесей. Что касается межфазной свободной энергии, с термодинамической точки зрения, увеличение скорости зародышеобразования должно наблюдаться, когда в растворе присутствуют примеси [22], потому что любая адсорбция на ядре уменьшает γ [23].Однако кинетически адсорбирующие примеси могут удерживать ядро ​​в докритическом размере [22]. Таким образом, скорость зародышеобразования может быть резко снижена. Сообщалось, что примеси, присутствующие в концентрации 10 ⁻⁵ моль / л, могут снизить скорость зародышеобразования на десять порядков [24]. Biostelle et al. [22] отмечают, что существует конкуренция между кинетикой адсорбции примесей и кинетикой адсорбции и интеграции растворенного вещества, следовательно, требуется более длительное время зародышеобразования.

Более того, эта конкуренция может еще больше повлиять на рост кристаллов, когда зародыши развиваются и начинают превращаться в кристаллы.Примеси могут адсорбироваться на поверхности растущего кристалла, препятствовать добавлению свободных молекул и тем самым снижать скорость роста. Из-за отрицательного эффекта примесей на обеих стадиях кристаллизации наблюдаемая задержка образования кристаллов mAb04c в присутствии загрязняющего белка не была неожиданной. В нашей работе мы не изучали, какая стадия подвержена влиянию примесей.

Низкая скорость восстановления (31,3%) наблюдалась, когда mAb04c кристаллизовали из культурального супернатанта.В будущем расширенном процессе скорости зародышеобразования и кристаллизации необходимо будет контролировать, например, путем посева, подачи белка во время кристаллизации или испарения растворителя. Следовательно, получаемый в настоящее время урожай должен быть значительно улучшен при работе в более крупном масштабе.

Заключение

Кристаллизация белка может быть введена в качестве стадии очистки при последующей обработке mAb, хотя наши текущие результаты пока показывают, что она, вероятно, будет более полезной на более поздней стадии очистки, а не при первоначальном улавливании продукта.Здесь мы демонстрируем очистку моноклонального антитела за одну стадию кристаллизации из осветленного супернатанта клеточной культуры до чистоты> 90%, хотя и с неудовлетворительным выходом. Образование агрегатов было незначительным, как показывает SE-HPLC, и на активность связывания с белком A не влияла кристаллизация. Текущее время кристаллизации в несколько дней, необходимое для достижения равновесия, частично связано с недостатками диффузии пара и должно быть значительно улучшено в периодическом процессе с затравкой.Текущая работа сосредоточена на расширении масштабов и оптимизации процесса с точки зрения повышения урожайности. Нам хорошо известно, что в настоящее время только несколько интактных IgG были успешно кристаллизованы и что не существует универсального метода для быстрой идентификации условий кристаллизации для новых антител. Однако недавние результаты Lewus et al. [10], которым удалось кристаллизовать антитело там, где ранее не было найдено условий кристаллизации [9], обнадеживают. Прежде чем можно будет оценить полезность этого метода в более широком контексте, необходимо будет провести дополнительную работу с большим набором целевых mAb.