Действия для пролонгации полиса:

• Предоставить информацию по автотранспорту и лицам допущенным к управлению
• Проверить правильность введенной информации
• Выбрать способ оплаты полиса
• Получить полис на e-mail в течении 1-2 дней

Основным преимуществом пролонгации ОСАГО в Опора на нашем сайте является стоимость полиса, которая меньше на 10-20% за счёт того что всё совершается через интернет, нет обслуживающего персонала, арендованного офиса, а документ отправляется в электронной форме.

Отзывы

На данный момент нет ни одного отзыва.

Вы можете стать первым

Офисы

ЦБ отозвал лицензии у страховой компании «Ангара»

Банк России отозвал у страховой компании «Ангара» лицензии на осуществление добровольного имущественного и личного страхования, а также обязательного страхования по ОСАГО. Соответствующий приказ ЦБ опубликовал на своём сайте 29 марта.

Такое решение регулятор принял из-за того, что компания нарушила положения законодательства о порядке инвестирования средств страховых резервов и собственного капитала, говорится в приказе.

• 22 марта, 9:39

• 15 марта, 12:13

• 29 января, 11:35

«Ангара» сообщила об отказе от всех имеющихся лицензий ещё 27 марта. Как говорится в сообщении компании, «Ангара» является правопреемником страховой компании «Опора», которая в 2017 году приобрела портфель ОСАГО у СК «Уралсиб». В конце 2018 года «Опора» добровольно сдала лицензии, а страховой портфель передала «Ангаре».

«К сожалению, мы вынуждены констатировать, что компании не удалось разобраться с тем объёмом пеней, штрафов, прочих «накруток» от автоюристов и разного рода мошенников, которые мы получили в наследство вместе с портфелем «Уралсиб», – заявил вице-президент компании Роман Цуркан. – Печально, что страховому рынку до сих пор не удалось преодолеть несовершенство законодательства, которое позволяет автоюристам фактически убивать хорошие компании с историей. В связи с этим нами было принято решение отказаться от лицензий на страхование».

Страховая компания «Ангара» работает с 1992 года. Она осуществляет деятельность на территории Иркутской области и Бурятии, является членом Всероссийского союза страховщиков и Российского союза автостраховщиков (РСА). 

Еще один крупный страховщик ОСАГО в Приморье лишился лицензии

В минувшую пятницу, 1 июня, Банк России отозвал лицензию у еще одной страховой компании, работающей в Приморье, в том числе и на рынке ОСАГО. Так, компания «Хоска» лишилась лицензии из-за финансовой неустойчивости. Об этом сообщает «Приморская газета» со ссылкой на сайт регулятора.

Лицензии страховой «Хоска» были отозваны в связи с неустранением нарушений страхового законодательства.

— Лицензию отозвали из-за несоблюдения требований финансовой устойчивости и платежеспособности в части нормативного соотношения собственных средств и принятых обязательств, порядка и условий инвестирования собственных средств и средств страховых резервов, — отмечается в приказе об отзыве лицензии.

Реформа ОСАГО начнется летом

Отметим, что у компании было время на устранение неполадок, ведь с 21 мая Банк России лишь приостановил действие лицензии компании. На официальный сайт страховой компании зайти не получается — доступ к нему закрыт.

О том, что у страховой произойдет отзыв лицензий шли разговоры еще в марте, сообщил «Приморской газете» автоюрист Алексей Соколов, ведущий инстаграм-канал lаwyer_vdk. Он также ответил на главные вопросы приморцев, что теперь делать и куда обращаться.

— Если у виновника ДТП полис ОСАГО в «Хоске», либо в другой страховой компании с отозванной лицензией обращаться нужно в Российский союз автостраховщиков, — уточнил Алексей Соколов. — Если виновник ДТП застрахован в другой страховой с действующей лицензией — обращайтесь в страховую компанию виновника. Полис ОСАГО будет действителен до окончания срока действия, либо до ликвидации страховой компании.

Страховая группа «Хоска» работает на рынке Дальнего Востока более 26 лет и сейчас является одним из крупнейших страховщиков округа. Компания присутствует в 14 областных центрах и 50 населенных пунктах. По итогам 2016 года оан заняла 88-е место по размеру собранной страховой премии среди российских страховщиков, 36-е место по сборам ОСАГО и 18-е место в сегменте страхования финансовых рисков. По итогам 2017 года компания заняла 39-е место по объему сборов по ОСАГО в России.

15 января «Хоска» заявила, что передаст свой страховой портфель ОСАГО в АО «Страховая компания «Опора» (Рязань). Однако позже появилась информация, что портфель будет передан ООО «Страховая компания «Ангара» (Братск, Иркутская область).

Напомним, что «Хоска» второй за год страховщик ОСАГО в Приморье, у которого отозвали лицензию. В коне апреля компания «Дальакфес» лишилась лицензии после того как компания не смогла устранить нарушения — несоблюдение требований финансовой устойчивости и платежеспособности. Действие договоров страхования «Дальакфес» будет прекращено по истечении сорока пяти календарных дней с даты вступления в силу приказа органа страхового надзора об отзыве лицензии — с 13 июня 2018 года.

Как заниматься спортом при сильной близорукости

Близорукость — это, прежде всего, деформация глазного яблока с увеличением его по одной из осей. При этом сетчатка очень сильно натягивается на яблоко. Между тем подъем тяжестей провоцирует повышение внутриглазного давления, и если глаз слаб, можно тем самым добиться отслойки сетчатки — и слепоты, в конце концов.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Так что перед подходом к штанге проконсультируйтесь у офтальмолога, лучше в специализированном офтальмологическом центре.

Что скажет доктор?

Остается только строить предположения. Хорошие новости: кардио в любом случае разрешат. Если миопия небольшая (до трех диоптрий) и, главное, непрогрессирующая, тренироваться со штангой можно, хотя врачебный надзор все-таки не помешает. Если стекла в очках — толстые, и с каждым годом их толщина растет, то и без окулиста ясно, что остается плавание и гантели. Во всех случаях стоит быть особенно осторожным с силовыми упражнениями, заставляющими подолгу находиться в положении наклона вперед или поднимать ноги значительно выше головы. К таким упражнениям относятся: становая тяга, наклоны со штангой, приседания, тяжелые жимы лежа и швунги. Категорически не рекомендуется также заниматься контактными видами единоборств.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Кардио

Чередуйте эти тренировки так: понедельник — тренировка А, среда — Б, пятница — А и так далее. Если сил хватает, можно проводить кардиотренировки сразу после силовых. В этом случае тренировка Б предпочтительнее, ибо длится 10 минут.

Тренировка А: установите на беговой дорожке наклон два-четыре процента. Разомнитесь пять минут, после пройдите (не бежать) два-три километра с максимальной скоростью. Можно замедляться или ускоряться, главное — не останавливаться совсем. Каждую неделю прибавляйте по 300-500 метров, пока не достигнете 10 километров. Далее совершенствуйте только скорость.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Тренировка Б: сядьте на гребной тренажер и неспешно погребите три минуты (это разминка). Теперь ускорьтесь ровно на 20 секунд. Не останавливаясь, сбавьте темп вполовину. На такой «отдых» — по 10 секунд. Так вы пройдете один цикл. Сделайте восемь циклов подряд, после чего не спеша погребите еще два-три минуты.

Силовые тренировки

Упражнения выполняйте в формате круговой тренировки, то есть подряд, с минимумом отдыха между подходами.

Динамические выпады назад

Гантели в руки, ноги на ширину бедер. Большой шаг назад правой, а левую сгибаете в колене до тех пор, пока не опуститесь в глубокий выпад. Колено почти должно коснуться пола. Вернитесь в исходное положение и повторите, шагнув назад левой. 15 повторов для каждой ноги.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Важно: осторожнее с тяжестью гантелей! Упражнение ни в коем случае не должно выполняться до отказа.

Подтягивания на нижней перекладине

Гриф тренажера Смита или гриф в силовой раме на уровне пояса либо груди (второй вариант полегче). Ухватите гриф пошире плеч и повисните, выпрямив тело и ноги в линию. Подтянитесь, коснувшись грифа грудью и сводя лопатки. Вернитесь назад. Повторов максимум.

Важно: не забудьте остановиться за два-три повтора до отказа.

Подъемы таза с опорой одной ногой о медицинбол

Лягте на пол, ноги вместе, руки в стороны ладонями вниз. Поставьте одну ногу серединой стопы на медицинбол, другую выпрямите и поднимите. Сохраняя равновесие, напрягите заднюю поверхность бедра той ноги, что на мяче, и поднимите таз. Вернитесь в исходное положение. Как только спина коснется пола, повторите. 12-20 повторов для каждой ноги.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Важно: старайтесь не прогибаться в пояснице в верхней точке подъема таза. Это не опасно для зрения, зато может повредить пояснице.

Вертикальная тяга блока к груди

Хватайте рукоять блока шире плеч и садись на тренажер. Под упорными подушками только колени. Чуть прогнитесь назад в грудном отделе и вытяните плечи вверх. Начав с опускания плеч, подтяните рукоять к ключицам и сведите лопатки. Выдержите секундную паузу и вернитесь назад. 12-15 повторов.

Важно: старайтесь не откидываться назад, помогая себе корпусом.

Отведения с гантелями стоя

Встаньте прямо, в руках гантели, руки чуть согнуты. Ноги (на ширине бедер) чуть согните в коленях, корпус немного вперед. Не меняя исходного положения, разведите руки в стороны до уровня плеч. Задержитесь на секунду и вернитесь в исходное положение. 12-15 повторов.

Важно: следите за дыханием: выдох, когда опускаете гантели!

Грудной жим на тренажере сидя

Выбирайте любой тренажер, позволяющий жать на грудь в положении сидя. Сядьте на него, возьмитесь за рукоятки, выпрямите руки, сведите лопатки и чуть прогнитесь в грудном отделе позвоночника. Опустите рукояти на себя, сгибая руки и направляя локти чуть ниже уровня плеч. Вернитесь в исходное положение и повтори. Сделайте 10-12 повторов.

Новости Стерлитамака :: г. Стерлитамак. Стерлитамакский портал (СТЕРЛИТАМАК.РФ, СТР.РФ, СТЕРЛИТАМАК.РУ, СТР.РУ) :: Стерлитамак город

отзывов об ОСАГО. Платежи по ОСАГО (Росгосстрах): отзывы

Многие сегодня задумываются оформить страховой полис в компании Росгосстрах. Отзывы об ОСАГО довольно противоречивые, тем более что многие люди не прибегали к помощи специализированных страховых компаний, так как им просто важно, чтобы страховой полис всегда был у них в бардачке. Однако многие люди даже не знают, как действовать после наступления страхового случая.

Что это такое?

Если говорить об обязательном страховании, то о Росгосстрахе вспоминают очень много. Отзывы об ОСАГО, а также о широкой рекламной компании сделали бренд достаточно узнаваемым, но многие задумываются, нужна ли им вообще эта политика и стоит ли ее регистрировать в этой компании.

ОСАГО — полис обязательного страхования для любого владельца транспортного средства. Основная особенность этого страхового полиса заключается в том, что возмещение ущерба и убытков, причиненных транспортному средству или здоровью его пассажиров, осуществляется, если застрахованное лицо является виновником аварии.Тарифы на этот полис устанавливаются государством, и если у водителя нет этого полиса, то по дороге ему появляться запрещено. Другими словами, все компании предлагают (или, по крайней мере, должны предлагать) одинаковую стоимость и не обязательно обращаются в Росгосстрах. Отзывы об ОСАГО и многих других компаний часто бывают отрицательными, но в принципе ситуация в страховом бизнесе такова, что без проблем получить выплаты не всегда возможно.

Как происходит оплата?

Самым важным моментом, который следует знать об ОСАГО, является то, что эта политика регулирует ущерб и убытки, которые вы конкретно причинили каким-либо третьим сторонам, будь то транспортное средство или жизнь и здоровье тех пассажиров, которые в нем находились.Страхуя свою гражданско-правовую ответственность, по случаю вины вы полностью лишаетесь заботы о нанесенном ущербе, и это вариант страхования, предоставляемый Росгосстрахом. Отзыв об обязательном страховании автогражданской ответственности свидетельствует о том, что обязательное оформление полиса очень важно, поскольку убытки невиновного человека могут быть восстановлены в кратчайшие сроки.

В этом случае автомобиль застрахованного лица, а также его жизнь, здоровье или имущество никаким страховым полисом не защищены.Возмещение ущерба, понесенного лично вами, уже будет осуществляться за их деньги или, в случае страхового полиса КАСКО, страховой компанией. Именно по этой причине нет оснований сомневаться в необходимости оформления данного полиса, остается только выбрать — делать это в определенной компании или пойти по оферте, которую делает страховая компания Росгосстрах. В комментариях к ОСАГО сказано, что оформление КАСКО дополнительно должно выполняться в любом случае.

У любого водителя должен быть свой собственный полис ОСАГО или, как минимум, он должен быть включен в такой полис.Это правило действует даже тогда, когда автомобиль просто везут из автосалона к месту регистрации, и единственным исключением в этом случае являются ситуации, когда в полисе ОСАГО нет ограничений на количество лиц, которые могут управлять автомобилем, И этот вариант также предоставляет страховая компания «Росгосстрах». Отзывы об ОСАГО такого типа говорят о том, что рядовому автовладельцу это в принципе не нужно.

Если у вас нет собственного полиса ОСАГО, вы не имеете права выезжать на дорогу, и вы даже не можете зарегистрировать свой автомобиль в ГИБДД.Помимо прочего, для такого водителя ожидаются серьезные неприятности, если в случае аварии он просто не сможет предоставить этот документ.

Если вы управляете автомобилем, вы всегда должны иметь при себе оригинал этого документа, независимо от того, оформлен ли он другой компанией или все же Росгосстрахом. Обзоры выплат по обязательному страхованию автогражданской ответственности говорят о том, что хотя они могут быть недостаточными (в длительных судебных процессах иногда приходится «вытаскивать» все выплаты), но все же во многом помогает решить проблему водителя или водителей, которые стали участниками ДТП по вашей вине.Если у вас есть полис, но вы просто забыли его дома, то в этом случае инспектор может отправить ваше транспортное средство на стоянку, откуда его можно забрать только при предъявлении этого документа.

Страховые выплаты

В соответствии с действующим законодательством полностью регламентированы отдельные нормы возмещения ущерба стороне, понесшей убытки в результате ДТП или наступления другого страхового случая, то есть Росгосстрах не устанавливает правил в этом случае.В комментариях к выплатам ОСАГО говорится, что это не всегда соблюдается, и зачастую компенсации ниже соответствующих.

Закон устанавливает максимально возможный лимит выплат по обязательному автострахованию ОСАГО, в пределах которого страховая компания обязана полностью перечислить компенсацию пострадавшему или провести ремонтный ремонт автомобиля до первоначального вида за свой счет.

Также в соответствии с действующим законодательством существует ряд условий, при которых ущерб, причиненный по вине застрахованного лица, просто не может быть возмещен страховым полисом Росгосстраха.В комментариях к ОСАГО (Москва) часто говорится, что нужно заранее разбираться в таких тонкостях, чтобы требовать выплаты от страховой компании, будучи уверенным в своей правоте.

Срок

В большинстве случаев ОСАГО выдается на один год, но на самом деле, при необходимости, вы можете подать заявление на получение этого полиса сроком на три месяца. Если у вас есть автомобиль, который зарегистрирован за границей, но вы используете его на территории Российской Федерации, то вам необходимо оформить временное пользование автомобилем (не менее 15 дней в любой компании, в том числе в Росгосстрахе).Страховая компания (отзывы клиентов ОСАГО — источник) может отказать в оформлении полиса на определенный срок и наложить более длительный срок, но на самом деле вы имеете право потребовать «двухнедельный» полис.

Стоимость

В отличие от КАСКО, цена которого может существенно отличаться у разных компаний в зависимости от их ценовой политики, размер ОСАГО является фиксированным и определяется в соответствии с коэффициентами и тарифами, определяемыми государством. По сути, это правило является гарантией того, что страховые компании не имеют возможности занижать или завышать стоимость этого полиса, даже если автострахование ОСАГО (Росгосстрах) оформлено.Отзывы говорят, что в принципе компания соответствует этому требованию, но, как уже было сказано выше, для увеличения стоимости часто навязчиво предлагается воспользоваться дополнительными услугами.

Сама цена ОСАГО для каждого конкретного водителя определяется отдельно, и в этом случае рассчитывается марка застрахованного транспортного средства, опыт вождения от владельца транспортного средства, регион, в котором будет использоваться автомобиль, а также многое другое. моменты учтены. Каждый отдельный показатель устанавливает индивидуальный понижающий или повышающий коэффициент, величина которого довольно жестко регулируется различными государственными постановлениями.

Как работает политика?

Изначально законодательством предусматривался только один вариант расчетов — потерпевшая сторона, понесшая убытки в результате аварии, а не по ее вине, должна была подать апелляцию в страховую компанию лица, причинившего ущерб. Однако недавно было принято решение внести определенные изменения в порядок получения страхового возмещения, чтобы процедура получения денег при наступлении страхового случая не была такой сложной.Согласно этим поправкам, если в ходе аварии не было причинено никакого вреда здоровью человека, и соблюдено большинство дополнительных условий, можно обратиться за возмещением ущерба к его страховщику, как правило «прямое возмещение убытков». повреждения »работает. Кроме того, если ущерб не превышает 50 000 рублей, то в этом случае даже не нужно вызывать сотрудников ГАИ, и можно использовать так называемый Европейский протокол.

Рассмотрение претензий о возмещении убытков от страховой компании рассматривается не более 20 дней, и это важно учитывать при формировании полиса, а также при наличии суда с Росгосстрахом (ОСАГО).Отзывы владельцев такого полиса показывают, что зачастую слишком долгое затягивание рассмотрения дела в конечном итоге приводит к тому, что компании намного проще отсудить платеж в полном объеме, если ранее она отказалась его предоставить. При этом не следует забывать, что за каждый день просрочки страховой компании придется заплатить штраф в размере 1/75 рефинансирования ЦБ от суммы ущерба.

Ограничения по верхней планке страховых выплат часто приводят к тому, что полис ОСАГО Росгосстрах не может покрыть всю сумму ущерба.В отзывах иногда указывается, что если последствия ДТП слишком разрушительны, то в таком случае всю разницу между ущербом и выплатой страховой компании придется восстанавливать самостоятельно. Именно по этой причине рекомендуется дополнительно оформить еще один полис DSAGO, позволяющий производить оплату в любой ситуации.

Неужели все так просто?

На первый взгляд многим кажется, что «подводных камней» по сравнению с КАСКО практически нет, но на самом деле, даже если они есть, не пренебрегайте выбором действительно надежной и ответственной страховой компании, ведь этим никто не будет заниматься. Вместо тебя.Если вы вдруг окажетесь виноватым в аварии, вам нужно будет полностью возместить ущерб, и нет разницы, поможет вам страховщик или нет — сумма потерпевшей должна быть выплачена полностью, поэтому многие люди на учете в страховании Росгосстраха. В комментариях к ОСАГО говорится, что к этой процедуре нужно подходить основательно, если вы хотите действительно серьезной помощи от своего страховщика в случае такого происшествия.

Также стоит отметить тот факт, что в любом случае специалисты рекомендуют выбирать полисы с ограниченным кругом лиц в страховании, так как это позволяет существенно сэкономить на оформляемом полисе.

В чем преимущества Росгосстраха?

Сама компания занимается этой сферой более 90 лет, поэтому гарантирует максимально доступное и качественное страхование, независимо от того, что вас интересует — страхование ДСАГО, КАСКО или ОСАГО. Росгосстрах, отзывы это подтверждают, в принципе выплаты производятся практически всегда, но очень много проблем по сумме, а также всевозможным скидкам и дополнительным услугам, первые из которых не учитываются, а вторые навязываются, но предоставляются редко.

Недавно компания запустила функцию электронного оформления политики и поддержки клиентов. Об этом также отмечают отзывы компании Росгосстрах. ОСАГО в этом случае содержит электронную подпись и впоследствии будет считаться действительным, как стандартный бумажный документ, просто распечатайте его.

Как подать заявку?

Даже если вы уже застрахованы в компании на ОСАГО, вы можете приобрести этот полис повторно, получив электронный документ через официальный сайт компании.Достаточно просто заполнить данные, зарегистрироваться в личном кабинете и оплатить заказ, после чего вы получите электронный полис. Кроме того, компания также предоставляет своим клиентам возможность оформить ОСАГО онлайн, но при этом получить бумажный документ в одном из офисов вашего города.

Стоит отметить тот факт, что на данный момент покупка онлайн-страхового полиса с возможностью дальнейшего бумажного документа предоставляется исключительно жителям столицы и Санкт-Петербурга.Санкт-Петербург, включая районы этих городов.

Если вы не привыкли пользоваться компьютером или не предпочитаете этот вариант, то в этом случае вы можете посетить один из множества офисов по всей стране, независимо от города, в котором вы находитесь. Кроме того, компания также предоставляет услугу вызова страхового агента в офис или на дом, который ответит на любые ваши вопросы, а также при необходимости оформит страховку на месте. Также вы можете спросить об оплате ОСАГО при ДТП (Росгосстрах).Обратная связь, конечно же, расскажет вам более подробную информацию обо всей процедуре, но агент вы можете узнать основные правила, а также ознакомиться с особенностями контракта, который вы подписываете.

Стоит отметить, что при оформлении страховки вы не просто получаете какую-то бумагу, но имеете право на получение выплаты в том случае, если вы стали виновником ДТП. Компания онлайн-сервиса позволяет сделать этот процесс максимально комфортным и быстрым, ведь через личный кабинет на официальном сайте вы всегда можете проверить состояние платежного случая или сделать заявление о наступлении страхового случая.

Полезные изменения законодательства

Есть несколько полезных законодательных изменений, которые необходимо учитывать в процессе выдачи политики:

• Максимально возможный материальный ущерб составляет 400 000 рублей, но данная норма распространяется только на те договоры, которые были заключены после 1 октября 2014 года;
• Максимально возможный вред здоровью или жизни после ДТП достигает 500 000 рублей, но эта норма актуальна только для договоров, оформленных после 1.04.2015;
• Возмещение может быть востребовано из вашей страховки в случае, если только два человека являются участниками аварии, и ущерб был причинен исключительно транспортным средствам, в то время как в других ситуациях вам придется напрямую связаться со страховой компанией лица, которое является виновник аварии;
• Максимально возможный размер ущерба, на который можно обратиться в страховую компанию без необходимости вызова ГИБДД, составляет 50 000 рублей, если оба договора водителей ОСАГО были заключены после 2.08.2014;
• Срок урегулирования всех вопросов после получения заявки — 20 дней, отсчет начинается сразу после подачи полного пакета документов, и в течение этого срока компания должна отправить мотивированный отказ, предоставить направление на ремонт, или произвести оплату;
• Если страховая компания имеет договор со станцией профессионального технического обслуживания, то у потерпевшего есть возможность выбора между прямой оплатой наличными, а также направлением своего транспортного средства на ремонт в случае, если договор обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств был выдан им после 1 сентября 2014 года.

Данные правила действуют даже в том случае, если вы не регистрируетесь в Росгосстрах ОСАГО. Отзывы клиентов говорят о том, что соблюдение каждого отдельного правила необходимо будет контролировать как можно тщательнее, чтобы в случае любого судебного разбирательства вам было намного проще защитить свое дело.

Полис ОСАГО является обязательным, поэтому оформлять его нужно будет в любом случае, независимо от того, выберете ли вы Росгосстрах или другую компанию.В этом случае важно определиться с выбором действительно надежного страховщика, который будет готов разбираться в каждом отдельном случае и платить деньги в соответствии с законом.

В любом случае покупать полисы рекомендуется только у действительно известных компаний, так как статистика показала, что примерно 2% от общего количества полисов — поддельные (источник — Росгосстрах, ОСАГО, ОМСК). В отзывах часто говорится, что приобретая полис в неизвестной компании, вы можете потерять много сил, нервов и времени в случае обнаружения неправильной или недействительной регистрации страхового полиса в случае дорожно-транспортного происшествия.

Если вы не уверены в подлинности своего страхового полиса, вы можете проверить его даже онлайн на официальном сайте PCA.

И помните, что ОСАГО не защищает вашу машину, а защищает только вашу ответственность перед остальными водителями. Поэтому дополнительный страховой полис КАСКО лучше оформлять отдельно.

Убийц Цветочной Луны: Леонардо Ди Каприо боролся за изменение сценария

Рот говорит, что съемки начнутся в марте 2021 года, ровно через год после того, как камеры изначально должны были начать работать.

Сценарий Эрика Рота «Убийцы цветочной луны» продолжает переписываться, поскольку следующая криминальная эпопея Мартина Скорсезе ждет начала съемок до 2021 года. Первоначально камеры должны были начать показ «Цветочной луны» в марте 2020 года, но пандемия вынудила проект отложить. В августе появились новости, что производство «Цветочной луны» начнется в феврале 2021 года, но Рот говорит в последнем выпуске подкаста «Script Notes», что март 2021 года является более вероятной датой начала. Рот также подтверждает слухи о том, что Леонардо Ди Каприо пытался переписать первоначальный черновик Рота.

«Я потратил четыре или пять лет на эту книгу« Убийцы цветочной луны », которую должен прочитать каждый. — Замечательная книга, — сказал Рот. «Я считаю, что мой сценарий точно соответствовал книге. Это история индейцев осейджей, 1921 год, самых бедных людей в Америке, которые обнаружили нефть на этой ужасной земле в Оклахоме, куда их привезли. Затем каждый убийца в Америке приходит, чтобы убить 184 из них за их деньги, но этот действительно героический парень приходит [чтобы помочь] ».

Связанные

Связанные

Рот продолжил: «Съемки должны начаться в марте, когда коронавирус исчезнет, ​​и это будет Мартин Скорсезе.Они будут продолжать переписывать с этим. Леонардо [Ди Каприо] хотел изменить некоторые вещи, о которых мы спорили. Он выиграл половину [аргументов]. Я выиграл половину из них. Так что это происходит ».

Слухи о драме «Цветочная луна» распространяются с мая, когда The Hollywood Reporter опубликовал статью, в которой объясняется, что пересмотр ДиКаприо оригинального сценария Рота был основным фактором, повлиявшим на решение Paramount Pictures продать фильм Apple. В версии фильма Рота ДиКаприо играл главного героя, федерального агента, работающего на недавно созданное ФБР, которое направляется к нации осейджей, чтобы раскрыть серию убийств.ДиКаприо настаивал на пересмотре сценария, чтобы он взял на себя племянника злодейского убийцы, которого сыграл Роберт Де Ниро.

Per THR: «В исправленной версии ДиКаприо изобразит племянника злодея Роберта Де Ниро, разрывающегося между любовью и злыми махинациями своего дяди. Источник, знакомый с ситуацией, говорит, что Paramount посчитала, что это превратило фильм в угрюмое и менее коммерческое исследование персонажей … После того, как Скорсезе и ДиКаприо пересмотрели «Убийцы цветочной луны», Paramount уполномочила давнего менеджера ДиКаприо Рика Йорна продвигать проект.Несомненно, студия надеялась, что никто не возьмется за это дело, что могло бы убедить Скорсезе вернуться к первоначальной идее и ожидаемому бюджету ».

Рот изначально адаптировал для своего проекта одноименную книгу Дэвида Гранна. Основываясь на интервью подкаста сценариста «Script Notes», похоже, что версия «Цветочной луны», которая будет запущена в производство в 2021 году, будет составлять лишь 50 процентов от первоначального видения, которое он имел для фильма. Слушайте полное интервью подкаста здесь.

Подпишитесь: Будьте в курсе последних последних новостей кино и телевидения! Подпишитесь на нашу рассылку новостей по электронной почте здесь.

65apps Отзывы клиентов | Clutch.co

Какими доказательствами вы можете поделиться, чтобы продемонстрировать влияние соглашения?

Мы запустили приложение, и теперь мы видим первые загрузки и результаты. Качество намного лучше. Исходные приложения были непонятны, да и связь с самим устройством нестабильная.

С 65приложениями мы смогли создать удобное и стабильное приложение.

Как 65apps работали с точки зрения управления проектами?

У нас есть собственные инструменты управления проектами, которые мы используем для разных целей, чтобы отслеживать разные вопросы. Еще мы используем Telegram, где у нас есть вся команда.

Когда я впервые начал с ними общаться, я общался с менеджером по продажам или менеджером по развитию бизнеса. Когда мы решили, что будем работать с ними, они сказали мне, что ему нужна пара недель, чтобы подобрать мне команду, чтобы я мог общаться с ними в привычном стиле.Мне было комфортно с командой на протяжении всего проекта.

Они понимали каждую мою интонацию, и это очень упростило процесс, потому что я мог им доверять. Мы говорили на одном языке, и я считаю, что это сделало весь процесс эффективным и легким. Я искренне верю, что результат отличный, потому что сейчас мы участвуем в нескольких соревнованиях с приложением здесь, на нашем рынке.

Менеджер проекта везде в моем телефоне и по электронной почте. Она просто очаровательный и профессиональный человек.

Что вас больше всего в них впечатлило?

Они попросили меня рассказать о них другим потенциальным клиентам на российском рынке. Руководители проектов этих компаний сказали мне, что они использовали двух других внешних разработчиков приложений, но они были недовольны отсутствием связи.

С 65приложениями от них буквально не избавиться. Если у них есть какие-либо вопросы или проблемы, или если они с чем-то борются, они получат от вас то, что им нужно.Иногда я чувствовал себя подавленным, но, с другой стороны, я знал, что этот проект не остановится, потому что они придут ко мне и заставят обратить на меня все внимание мира.

Есть ли области, в которых они могли бы улучшить?

Им не следует так настойчиво пытаться получить от меня информацию, когда я перегружен другими задачами, хотя я люблю их за это качество. С другой стороны, на них трудно не сердиться; как будто они немного летают вокруг вас.

✅ [Обновлено] British Auto Club osago, помощь на дороге, парковка Мод Скачать приложение для ПК / Android (2021)

Вы можете загрузить British Auto Club osago, помочь в дороге, бесплатно припарковать приложение и установить его на свое устройство, перейдя в магазин Google Play. Google play рекомендует не загружать приложения для Android напрямую из сторонних источников, так как они могут нанести вред вашему телефону.
Вы можете скачать официальное приложение British Auto Club osago, помощь в дороге, парковка, щелкнув ссылку ниже в магазине Google Play.

Что такое APK-файл?

APK — это аббревиатура от Android Package Kit. Операционная система Android использует собственный тип формата установки, как и программное обеспечение Windows, имеющее расширение .exe. Когда вы загружаете приложение из магазина Google Play, оно загружается и устанавливается в формате APK.

Вы не увидите файл напрямую, когда загрузите его из магазина воспроизведения. Иногда вам может потребоваться загрузить файлы APK из других источников напрямую.

Каковы преимущества и недостатки прямой загрузки APK?

Преимущества:

1. Вы можете скачать любую версию приложения прямо со сторонних сайтов.У них могут быть архивы приложений большинства версий, и вы можете скачать ту, которая вам может понадобиться.
2. В отличие от игрового магазина загрузка происходит мгновенно, не нужно ждать процесса проверки и т. Д.
3. После загрузки у вас будет APK-файл на вашей карте памяти / в системной памяти. Таким образом, вы можете удалять и повторно устанавливать любое количество раз без необходимости загрузки.

Недостатки:

1. Загрузка приложений из сторонних источников обычно не проверяется Google. Это может быть вредно для вашего телефона.
2. Файлы APK могут содержать вирусы, которые украдут данные с вашего телефона или повредят ваш телефон.
3. Ваши приложения не будут обновляться автоматически, поскольку у магазина Google Play обычно нет к нему доступа.

Где можно скачать APK файл British Auto Club osago, помощь в дороге, парковка?

Вы можете скачать APK любого приложения для Android из многих источников, таких как ApkMirror, ApkPure и т. Д. Но мы настоятельно не рекомендуем скачивать из сторонних источников. Мы добавили кнопку выше, чтобы загрузить British Auto Club osago, помочь в дороге, парковать официальный файл приложения. Всегда загружайте Android из магазина Google Play, если у них нет приложения, которое вы ищете.

Как установить British Auto Club osago, помощь в дороге, парковку APK с телефона android?

1. Вы можете скачать APK-файл British Auto Club osago, помощь в дороге, парковка, нажав кнопку выше, после чего начнется загрузка. После завершения загрузки вы сможете найти APK в разделе «Загрузки» в своем браузере.
2. Прежде чем вы сможете установить его на свой телефон, вам необходимо убедиться, что на вашем устройстве разрешены сторонние приложения. Чтобы включить это, шаги в основном аналогичны приведенным ниже.
   Откройте меню > Настройки> Безопасность> и установите флажок Неизвестные источники , чтобы разрешить вашему телефону устанавливать приложения из источников, отличных от Google Play Store.
3. Выполнив вышеуказанный шаг, вы можете перейти к «Загрузки» в своем браузере и один раз коснуться загруженного файла APK.Он начнет показывать запрос на установку, запрашивающий разрешения, и вы можете выполнить шаги, чтобы установить его.
4. После завершения установки вы можете начать использовать приложение, как обычно.

Как скачать Android-приложение British Auto Club osago, помощь в дороге, парковка для ПК (компьютер с Windows / Mac)?

1. Чтобы использовать приложение Android со своего компьютера, вам понадобится программа-эмулятор Android , которая действует как виртуальный телефон.Ниже приведены пошаговые инструкции по установке и использованию приложений Android на ПК.
2. Сначала нам нужно скачать и установить эмулятор Android. BlueStacks — один из наиболее часто используемых эмуляторов Android. Его можно загрузить и использовать совершенно бесплатно.
3. Вы можете скачать его по приведенной ниже ссылке после инструкций.
4. После того, как вы загрузите программное обеспечение эмулятора, вы можете установить его, как и любое другое компьютерное программное обеспечение, дважды щелкнув и выполнив шаги.
5. После установки эмулятора откройте его и перетащите загруженный файл APK на экран программного обеспечения. Это запустит процесс установки приложения.
6. Следуйте инструкциям, чтобы завершить установку APK, как в телефоне.
7. Поздравляю. Теперь вы можете использовать приложение Android со своего компьютера, открыв программу-эмулятор.

Что такое ОСАГО Британского автоклуба, помощь в дороге, парковка последней версии, дата выпуска и дата первоначального выпуска?

British Auto Club osago, помощь в дороге, последняя стабильная версия парковки — 1.5, выпущенный 18 мая 2020 г. Размер загружаемого приложения — 8,9 МБ.

Сколько стоит British Auto Club osago, помощь в дороге, парковка и как сделать предзаказ / купить?

Его можно скачать БЕСПЛАТНО, и вы можете скачать его в магазине Google Play. Поскольку приложение уже выпущено, вы можете покупать его прямо в магазине.

British Auto Club osago, помощь на дороге, парковка в моей стране запрещена.Законно ли получить к нему доступ через VPN?

Совершенно незаконно использовать приложение (British Auto Club osago, помощь в дороге, парковка), пока оно запрещено в вашей стране. Однако вы можете получить доступ по особым причинам, таким как закрытие учетной записи или получение вашего контента / денег из приложения. Вы можете использовать VPN другой страны и получить к ней доступ. Мы настоятельно рекомендуем не использовать его с VPN, так как это может вызвать юридические проблемы.

Какой лучший VPN для использования с British Auto Club osago, помощь в дороге, парковка?

Если вы по каким-то причинам хотите получить доступ к British Auto Club osago, помощь в дороге, парковку с использованием VPN, вы можете попробовать одну из нескольких перечисленных ниже VPN.Это лучшие VPN-сервисы, которые опробовали и используют миллионы пользователей по всему миру. Кроме того, они просты, быстрее и обеспечивают полную поддержку и безопасность при их использовании.

1. ExpressVPN
2. NordVPN

Е-ОСАГО Шредингер на примере Тинькофф Страхование. — Blogh2.com

Мы настолько привыкли к тому, что многое можно сделать с помощью телефона или компьютера, не выходя из дома, что не всегда думаем, что все это великолепие основано на желании компаний предоставить это великолепие.Мы не говорим о случаях технических сбоев и каких-либо неисправностей, так как от поломок никто не застрахован и они случаются даже с самыми, казалось бы, надежными и многократно дублируемыми услугами. Речь идет о прекращении работы сервиса по инициативе компании в одностороннем порядке. Чаще всего эта причина становится экономическим недостатком данной услуги или услуги, и компания просто перестает предоставлять услугу. Это часто случается с разного рода проектами, которые себя не оправдали.Это вина как небольших стартапов, которые, как говорится, «не взлетели», так и гигантов, которые не добились успеха. В этом случае пользователи заранее уведомляются о прекращении поддержки и последующем закрытии службы или службы. Все честно — бизнес есть бизнес, и компания не обещала, что услуга будет предоставляться вечно.

Однако бывают и другие ситуации, когда онлайн-сервис вроде бы есть, но для его использования нужно пройти семь кругов ада, и иногда проще отказаться от «удобного» удаленного варианта в пользу традиционного посещения. в офис.

Наиболее ярким примером такой услуги Шредингера является регистрация полиса E-CMTPL.

На бумаге все страховые компании, которые предоставляют услуги по оформлению полисов ОСАГО, также обязаны предоставлять удаленную услугу по выдаче этого полиса, не посещая офис страховой компании. И, на первый взгляд, у этих компаний есть схожая услуга, однако по разным причинам пользователь, желающий оформить именно эту политику E-CMTPL, может столкнуться с множеством препятствий, не все из которых будут очевидными.Первое, что приходит в голову, это то, как страховые компании пытались усложнить жизнь пользователям с кодами проверки, в которых использовались символы из разных раскладок клавиатуры, написанные на разных языках, что привело к виртуальной невозможности ввести правильный код проверки, из-за чего Расстроенный потенциальный покупатель был вынужден искать другие способы получить полис. Например, визит в офис компании, где он, скорее всего, наткнулся на страхового агента, который хотел продать клиенту дополнительные услуги.Да, можно сказать, что проблема надуманная и есть способы ее решения в виде выдачи полиса заказным письмом, но зачем тогда вообще создавать сервис, чтобы всячески его дискредитировать? Ладно, вопрос с кодами подтверждения решил законодательно урегулировать и отрегулировать этот процесс.

Но на этом проблемы пользователей не закончились, что я не так давно в полной мере испытал на себе.

Толчком к написанию этого материала, как обычно, послужила жизнь, поставившая свинью на банку Тинькофф, которую так любили до этого инцидента, продуктами которой я пользуюсь уже давно.Вернее, ситуация сложилась не с банком, а с Тинькофф Страхование, но сути это не меняет, так как основное название в названии организации то же самое.

Итак, в связи с истечением срока действия полиса ОСАГО на машину отца возник вопрос с его продлением. Где подать заявку на полис? Конечно, на Тинькофф. Недолго думая, открываем сайт Тинькофф, переходим на страницу регистрации полиса, заполняем данные и нажимаем «Узнать стоимость».Указываем адрес электронной почты два раза. Я не просто заостряю внимание на этом моменте. Мы обязательно к этому вернемся.

Как вы думаете, что произойдет после нажатия на «Рассчитать стоимость»? Сайт вяло отсчитает секунды, а потом…

А потом вдруг будет редирект на сайт compare.ru с переносом всех заполненных вами данных на сайт compare.ru.

Да, перед нажатием кнопки «Рассчитать стоимость» мы ставим отметку о согласии с правилами регистрации, но почему пересылка происходит без предупреждения? Почему принудительно? На каком основании? Где хоть слово про возможную переадресацию? Но это не так.Просто Тинькофф решил за тебя. И можно отнести к частному случаю, но я экспериментировал с машинами друзей — переадресация работает в 100% случаев вне зависимости от машины, личности владельца, года выпуска и т. Д.

Если бы я хотел получить полис на сайте compare.ru, то, наверное, сразу пошел бы и обошелся без посредничества Тинькофф Страхование.

Самое смешное, что на сайте compare.ru, куда нас перевели, самого Тинькофф может вообще не оказаться в списке предлагаемых страховых компаний.Такая ирония?

Что делать? Есть четыре варианта.

Первый : принять такое поведение страховой компании за норму, оформить полис в другой страховой компании, одной из предлагаемых сервисом compare.ru (недопустимо, так как нагло навязанная услуга хуже, чем ее полное отсутствие)

Второй : попробуйте вернуться на сайт Тинькофф и сделайте еще одну попытку (неудачная — вас отправят обратно на compare.ru)

Третий : плюнуть на Е-ОСАГО и оформить политику традиционным оффлайн способом.

Четвертый : написать в поддержку с просьбой исправить ситуацию.

Из-за наивности и розовых очков перед глазами выбираем четвертый вариант и пишем в техподдержку.

После того, как мне удалось дозвониться до «Олега», я получил ответ, что переадресация на compare.ru нормальная. Ответ замечательный.

На просьбу дать возможность оформить без посредников получил ответ — ждите, вам ответят в течении XNUMX часов.Ждем, при этом снова тронутый службой поддержки ответ на вопрос о причинах переадресации: compare.ru — наш партнер, а пересылка там нормальная.

Правда? Вы серьезно? Это нормально, если я не могу выдавать, где хочу, и принудительное перенаправление на сторонний ресурс с передачей моих данных на этот ресурс? Ладно, запишем.

А пока попробуем оформить Е-ОСАГО не через сайт, а через приложение Тинькофф, так как никуда из приложения перенаправлять не надо.

Итак, заполняем данные. Проверяем всю информацию еще раз. И мы стараемся это устроить.

После недолгого ожидания мы получаем сообщение о том, что что-то пошло не так.

Я наивен и упрям. Давай попробуем снова. Однако, как я ни старался, всегда что-то шло не так.

А так можно бесконечно пробовать, каждый раз будет ошибка.

И здесь есть только два пути — подождать, надеясь, что саппорт что-то решит, или попытаться поторопиться.

Выбираем второй способ и пишем, что вам некогда ждать. Обещают ускорить процесс с одного дня до двух часов.

Примерно через час у меня снова закончилось терпение, и я пытаюсь выдать его снова.

Вдруг все налаживается, и полис оформляется без проблем. Вернее, я так и думал, без проблем.

В тот момент я очень торопился и поэтому не придал значения тому, что уведомление о регистрации полиса пришло ко мне только в виде текстового сообщения, а сам полис на электронную почту не пришел. -почта, указанная в анкете.Ни сам полис, ни даже письмо с уведомлением о регистрации на почту не пришло.

Помните, в самом начале я сосредоточился на адресе электронной почты в анкете? И поэтому. Спустя какое-то время я решил сохранить политику в виде документа на случай, если в нужный момент нет доступа в Интернет. Захожу в личный кабинет, и в поле «Адрес электронной почты» вижу нечто совершенно отличное от того, что я указывал при регистрации (дважды), но все равно сравнивать.ru

Мои эмоции в данный момент сложно описать цензурными словами.

Ничего не могу сказать, поэтому все, что написано дальше, — это только мои мысли и предположения. Может быть, раз уж уловку с перенаправлением не получилось, нужно каким-то другим способом слить данные клиента с партнером? Выход есть — незаметно меняем адрес электронной почты клиента на непонятный набор символов, который может случайно совпадать с адресом электронной почты партнера, где собраны все данные таких дотошных клиентов, которым все же удалось обойти ошибку и оформить политику.Выгода.
Да, все это только мои догадки, а поддержка вопроса «на каком основании» относится к аварии и ошибке, обещает разобраться, и в итоге мы разобрались, просто заменив непонятный адрес из сравнения. ru в анкете с другой, но не той, которую я указал при регистрации полиса, и той, которая была ранее сохранена в моем личном кабинете другого банковского продукта. Это забавно. И я не верю в ошибку, которая происходит исключительно в пользу партнера, на сайт которого вас принудительно перенаправляют.Но, увы, кроме скриншота с «неправильным» адресом у меня нет никаких доказательств.

Скорее всего, при очень желании можно попытаться докопаться до истины в вопросе, была ли это случайная системная ошибка, в какой момент и почему изменился адрес. Также при желании можно понять причины ошибки, не позволяющей оформить политику. Надо просто в сервисном коде покопаться, а кто там доступ даст. Это требует много времени и административных ресурсов, да и то не факт, что что-то будет найдено.

Вместо этого я выберу другой путь. После всей этой балансировки есть четкое понимание, что на этом наше сотрудничество с Тинькофф закончилось из-за потери доверия. Потребуется еще время, чтобы найти альтернативу и привести все в порядок, после чего я начну процесс закрытия всех продуктов компании, которые я использую в настоящее время.

Заключение

Проблемы с Е-ОСАГО продолжаются более года, и многие автомобилисты и мотоциклисты уже имели счастье сталкиваться с подобными трудностями.Информацию по этому поводу даже не нужно долго искать, она выпадает по запросу в любой поисковой системе.

Вы можете теоретизировать и попытаться представить себе причины такой ситуации. Учитывая особенности самого продукта ОСАГО, которые страховщики обязаны предоставить по закону, простейшее предположение о причинах ошибок и других сложностей — это то, что сам продукт ОСАГО убыточен для определенного типа клиентов / автомобилей / регионов. Таким образом, страховые компании могут бороться за прибыль.Но, с другой стороны, меня как потребителя услуг это совершенно не должно беспокоить. Если вы не можете вести бизнес по правилам, уходите с рынка. Не хочешь уходить? Ведите свой бизнес цивилизованно. А может это действительно досадное недоразумение и случайная ошибка? Вы верите в случайность и совпадение? Мы очень активно (быстрее многих других стран) движемся к светлому электронному будущему, но на этом пути очень часто спотыкаемся о российские реалии.

Опубликовано админ

Посмотреть все сообщения администратора

Сообщение навигации

Никотинамидфосфорибозилтрансфераза / висфатин не катализирует образование никотинамидмононуклеотидов в плазме крови

Abstract

Никотинамид (Nam) фосфорибозилтрансфераза (NAMPT) является ферментом, ограничивающим скорость синтеза NAD у млекопитающих, катализирующим образование никотинамидмононуклеотида (NMN) из Nam и 5-фосфорибозил-1-пирофосфата (PRPP).NAMPT также был описан как адипоцитокин висфатин с множеством действий, хотя физиологическое значение этого белка остается неясным. Было высказано предположение, что возможные действия висфатина опосредуются внеклеточным образованием NMN. Однако мы не обнаружили NMN в плазме крови мышей даже с помощью высокоспецифической и чувствительной жидкостной хроматографии / тандемной масс-спектрометрии. Кроме того, во внеклеточных пространствах нет или мало АТФ, активатора NAMPT. Таким образом, мы задались вопросом, катализирует ли висфатин образование in situ NMN в такой внеклеточной среде.Чтобы ответить на этот вопрос, мы определили значения K _m для субстратов Nam и PRPP в реакции NAMPT без или с АТФ с использованием рекомбинантного человеческого фермента и обнаружили, что 1 мМ АТФ резко снижает значения K _m для субстратов, в частности PRPP, до его внутриклеточной концентрации. В соответствии с кинетическими данными, только когда АТФ присутствует на миллимолярных уровнях, NAMPT эффективно катализирует образование NMN при внутриклеточных концентрациях субстратов.Намного более низкие концентрации Nam и почти полное отсутствие PRPP и ATP в плазме крови позволяют предположить, что NAMPT не должен эффективно катализировать свою реакцию во внеклеточной среде. Действительно, NAMPT не образовывал NMN в плазме крови. Из этих кинетических анализов фермента и количественного определения его субстратов, активатора и продукта мы заключаем, что висфатин не участвует в образовании NMN во внеклеточной среде. Вместе с отсутствием NMN в плазме крови наш вывод не поддерживает концепцию «NAMPT-опосредованного системного биосинтеза NAD».«Наше исследование продвинет современное понимание физиологии висфатина.

Образец цитирования: Hara N, Yamada K, Shibata T., Osago H, Tsuchiya M (2011) Никотинамидфосфорибозилтрансфераза / висфатин не катализирует образование никотинамидмононуклеотидов в плазме крови. PLoS ONE 6 (8): e22781. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022781

Редактор: Матей Оресич, Государственный центр технических исследований Финляндии, Финляндия

Поступила: 16 февраля 2011 г .; Одобрена: 7 июля 2011 г .; Опубликовано: 3 августа 2011 г.

Авторские права: © 2011 Hara et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Это исследование было поддержано грантом на научные исследования (21580139). Спонсор не имел никакого отношения к дизайну исследования, сбору и анализу данных, принятию решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

В клетках млекопитающих НАД синтезируется посредством пути de novo из триптофана или путей спасения из никотинамида (Nam) и никотиновой кислоты (NA) [1]. Остаточный синтез инициируется добавлением фосфорибозильной части из 5-фосфорибозил-1-пирофосфата (PRPP) к соответствующим предшественникам с образованием соответствующих мононуклеотидов Nam и NA (NMN и NaMN) в реакциях, катализируемых ограничивающими скорость ферментами Nam фосфорибозилтрансферазой. (NAMPT) и NA-фосфорибозилтрансфераза (NAPRT) соответственно (рис.1), используя АТФ в качестве активатора [2] — [6].

Рис. 1. Метаболические пути синтеза спасательных НАД.

NaAD, адениндинуклеотид NA; NMNAT , аденилилтрансфераза NMN; NaMNAT , аденилилтрансфераза NaMN; NADsyn , НАД-синтетаза. Пунктирные стрелки указывают на возможный внеклеточный путь биосинтеза НАД [14].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022781.g001

Помимо того, что он является внутриклеточным синтетическим ферментом NAD, NAMPT, первоначально идентифицированный как фактор увеличения колонии пре-B-клеток [7], также был описан как новый адипоцитокин висфатин [8], потенциально связанный с ожирением, диабетом 2 типа и воспалительными заболеваниями [8] — [11].Однако из-за явно противоречивых ассоциаций между висфатином и этими заболеваниями в последующих клинических исследованиях [12], [13] физиологическое значение этого белка остается в значительной степени неясным.

Revollo et al. предположили, что внеклеточный висфатин действует посредством «NAMPT-опосредованного системного биосинтеза NAD» [9], [14]. В этом предложении предполагается, что Nam в кровотоке превращается в NMN с помощью висфатина, и полученный NMN распределяется по тканям, транспортируется внутрь клеток и превращается в NAD, чтобы вызвать зарегистрированные биологические эффекты.Последующие исследования также подтвердили возможное внеклеточное превращение Nam в NMN с помощью висфатина и новые функции образующегося NMN [11], [15]. Однако считается, что внеклеточные пространства содержат мало или совсем не содержат АТФ [16]. Таким образом, мы поставили под вопрос, является ли висфатин ферментативно активным в такой внеклеточной среде. Действительно, образование in situ NMN висфатином во внеклеточной среде непосредственно не исследовалось [9], [11], хотя ферментативная активность секретируемого NAMPT была продемонстрирована в условиях in vitro с достаточно высокой концентрацией АТФ [9].

Чтобы ответить на наш вопрос, мы сначала определили значения K _m для субстратов Nam и PRPP в реакции NAMPT с использованием рекомбинантного человеческого фермента в отсутствие или в присутствии АТФ. Затем мы оценили активность NAMPT во внутри- и внеклеточной среде на основе кинетических параметров, а также фактических внутри- и внеклеточных концентраций субстратов и АТФ, полученных в этом исследовании. Наконец, мы определили напрямую, катализирует ли NAMPT образование in situ NMN в плазме крови мышей.Наши результаты показывают, что висфатин не может эффективно катализировать свою реакцию во внеклеточной среде.

Материалы и методы

Материалы

[ Карбонил — ¹⁴ C] Nam (50 мКи / ммоль) и [ карбоксил — ¹⁴ C] NA (50 мКи / ммоль) были приобретены у American Radiolabeled Chemical Inc. (Сент-Луис, Миссури). , СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). АТФ, PRPP, люцифераза и люциферин светлячков были приобретены у Oriental Yeast (Токио, Япония), Sigma (Сент-Луис, Миссури, США) и Wako Pure Chemical Industries (Осака, Япония), соответственно.

Экспрессия NAPRT человека дикого типа и NAPRT дикого типа и мутантного человека

Рекомбинантные NAMPT и NAPRT получали, как описано ранее [17]. Вектор, используемый для экспрессии мутантного NAPRT, в котором His-213 заменен на Asn, был получен с использованием плазмидного вектора pET22b, несущего NAPRT дикого типа [17] и праймеров 5′-C GGG ACC CTG GCC aac TCC TTC GTC AC -3 ‘и 5’-GT GAC GAAGGA gtt GGC CAG GGT CCC G-3′, где измененный кодон обозначен курсивом в нижнем регистре.Мутантный фермент экспрессировали и очищали, как описано ранее [17].

Анализы NAMPT и NAPRT

Ферментные препараты инкубировали с PRPP и [ ¹⁴ C] Nam (50 мКи / ммоль) или [ ¹⁴ C] NA (50 мКи / ммоль) со стандартной реакционной смесью (30 мкл), содержащей 50 мМ Трис-Cl. ^— (pH 7,5), 10 мМ MgCl ₂ , 2,5 мМ дитиотреитол (DTT) и 1,5 мкг бычьего сывороточного альбумина (BSA) в присутствии или отсутствии определенных концентраций АТФ.После инкубации при 37 ° C в течение заданного времени реакционную смесь кипятили в течение 60 секунд, и образовавшиеся NMN и NaMN разделяли с помощью тонкослойной хроматографии и количественно определяли, как описано ранее [17]. Для кинетических анализов ферменты инкубировали с определенными концентрациями PRPP вместе с Nam или NA в стандартной реакционной смеси с или без АТФ при 37 ° C. Начальную скорость откладывали в зависимости от концентрации субстрата. Кривые были подогнаны с использованием метода нелинейной регрессии (DeltaGraph 5), из которого были получены K _m и V _max для каждой реакции.

Приготовление плазмы крови мыши

Протокол приготовления плазмы крови был одобрен этическим комитетом по экспериментам на животных Университета Симанэ (номера разрешений: IZ22–43, IZ23–38) в соответствии с Руководством по экспериментам на животных Японской ассоциации лабораторных зоотехник. Были приложены все усилия, чтобы минимизировать страдания животных. Кровь мышей C57 / BL в возрасте 6–13 недель отбирали в гепаринизированные шприцы под анестезией пентобарбиталом натрия.Если не указано иное, кровь немедленно смешивали с 1/50 объема 125 мМ EDTA / EGTA. После центрифугирования при 1500 × g при 4 ° C в течение 7 минут супернатант собирали и использовали в качестве свежеприготовленной плазмы.

Определение плазменных концентраций Nam, PRPP, ATP и NMN

Концентрации Nam и NMN в плазме определяли анализом жидкостной хроматографии / тандемной масс-спектрометрии (ЖХ / МС / МС). Свежая плазма была немедленно смешана с равным объемом 0.5 н. Хлорная кислота (PCA). После центрифугирования при 15000 × g в течение 5 минут супернатант нейтрализовали добавлением равного объема 1 М формиата аммония (pH 6,4). Количество Nam и NMN в супернатанте определяли с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра (API3000, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), как описано ранее [18].

Уровни PRPP в плазме определяли с помощью анализа NAPRT следующим образом. Свежую плазму немедленно кипятили в течение 60 секунд, охлаждали на льду и центрифугировали.Супернатант (5–10 мкл) инкубировали с 20 мкМ [ ¹⁴ C] NA (50 мКи / ммоль), рекомбинантным NAPRT (0,5 мкг), 50 мМ Tris-Cl ^— (pH 7,5), 10 мМ MgCl. ₂ , 2,5 мМ DTT, 1 мМ АТФ и 1,5 мкг БСА в конечном объеме 30 мкл. После инкубирования при 37 ° C в течение 15 минут реакционную смесь кипятили в течение 60 секунд и количество образовавшегося NaMN определяли с использованием анализа тонкослойной хроматографии, как описано выше. Наблюдалась линейная зависимость между количеством PRPP, добавленным в плазму (0.05–5 мкМ) и NaMN.

Уровни АТФ в плазме определяли с помощью анализа люциферин / люцифераза. Свежую плазму немедленно смешивали с равным объемом 0,5 н. PCA. После центрифугирования супернатант нейтрализовали формиатом аммония и разбавили в 20 раз H ₂ О. Смесь люциферин / люцифераза (430 мкМ люциферин, 8,6 мкг / мл люциферазы, 22 мМ Tris-Cl ^— (pH 7,8), 8,6 мМ MgSO ( ₄ ), 0,43 мМ EDTA, 4,3 мМ DTT, 86 мкМ пирофосфата натрия и 2,2 мг / мл BSA) добавляли к образцам, и люминесценцию образца сравнивали со стандартной кривой АТФ.

Определение разрушающей активности против PRPP, АТФ и NMN в плазме

Свежую плазму, приготовленную без добавления EDTA / EGTA, инкубировали с PRPP, ATP или NMN в присутствии или в отсутствие 2,5 мМ EDTA / EGTA. После инкубации при 4 или 37 ° C в течение указанного времени определяли количества этих фосфатированных соединений, остающихся в плазме, как описано выше.

Свежую плазму (30 мкл), приготовленную без добавления EDTA / EGTA, инкубировали с рекомбинантными NAMPT, PRPP и ATP в реакционной смеси (40 мкл), содержащей 50 мМ Tris-Cl ^— (pH 7.5) при 37 ° C в течение 10 мин. После прекращения реакции добавлением равного объема PCA образовавшийся NMN определяли количественно, как описано выше.

Статистический анализ

Статистические данные выражены как среднее ± стандартное отклонение. из n экспериментов.

Результаты

АТФ является важным активатором реакции NAMPT

Сначала мы определили значения K _m для субстратов Nam и PRPP в реакции NAMPT в отсутствие или в присутствии АТФ.Как показано в таблице 1, значения K _m для Nam и PRPP резко снизились с 8,06 до 1,22 мкМ и с 23,2 до 0,51 мкМ, соответственно, в присутствии 1 мМ АТФ. Взятые вместе с внутриклеточными концентрациями Nam и PRPP (около 10 и 1 мкМ соответственно [19] — [21]), кинетические данные предсказывают, что NAMPT будет проявлять значительную активность только в присутствии АТФ во внутриклеточных условиях. Действительно, когда NAMPT инкубировали с 20 мкМ Nam и 1 мкМ PRPP в присутствии 1 мМ АТФ, легко наблюдалось образование NMN, тогда как фермент не проявлял значительной активности без АТФ (таблица 2).Напротив, при гораздо более высоких концентрациях Nam и PRPP (50 мкМ) фермент проявлял значительную активность даже в отсутствие АТФ (таблица 2). Эти наблюдения показывают, что АТФ является важным активатором NAMPT при внутриклеточных концентрациях субстратов. Как показано на фиг. 2, миллимолярные уровни АТФ необходимы для значительной активности NAMPT во внутриклеточных условиях. АДФ, АМФ или НАД, концентрация каждого 1 мМ, не проявляли стимулирующего действия на активность фермента NAMPT (данные не показаны).Аналогичная потребность в АТФ наблюдалась для человеческого NAPRT, фермента биосинтеза НАД, также использующего PRPP в качестве субстрата и АТФ в качестве активатора [4] — [6] (Таблицы 1 и 2 и Рис. 2). Замена His-213 в NAPRT [17], который соответствует His-219 в Salmonella typhimurium NAPRT, который является ключевой аминокислотой, ответственной за активацию АТФ [22], на Asn сделал фермент нечувствительным к АТФ (Таблица 1).

Рис. 2. АТФ является важным активатором реакций NAMPT и NAPRT.

NAMPT (A, 15 нг) и NAPRT (B, 20 нг) инкубировали с 20 мкМ [ ¹⁴ C] Nam и [ ¹⁴ C] NA в течение 6 и 7 минут, соответственно, в присутствии 1 мкМ PRPP и указанные концентрации АТФ.Определяли количества образовавшихся NMN (A) и NaMN (B). Данные на рисунках 2 и 3 представляют как минимум три эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022781.g002

В плазме крови мышей, хотя Nam присутствует, PRPP и АТФ почти отсутствуют

Затем мы исследовали, проявляет ли NAMPT in situ ферментативную активность во внеклеточной среде, плазме крови, которая, как сообщается, содержит Nam [23], но мало или совсем не содержит АТФ [16].Мы определили концентрации Nam, PRPP и ATP в свежеприготовленной плазме крови мыши и оценили активность NAMPT во внеклеточной среде на основе кинетических параметров, определенных выше. Используя анализ ЖХ / МС / МС [18] и люциферин / люциферазный метод, мы определили концентрации Nam и АТФ как 4,6 ± 1,5 мкМ ( n = 3) и чрезвычайно низкие (1,3 ± 0,3 мкМ, n = 3). в плазме, соответственно, что согласуется с теми, о которых ранее сообщалось в циркуляции у млекопитающих в целом [16], [23].С помощью анализа NAPRT концентрация PRPP в плазме была определена ниже предела обнаружения (<50 нМ, n = 3). В отличие от предыдущего сообщения [9], NMN не был обнаружен в плазме (<50 нМ, n = 5) с помощью анализа ЖХ / МС / МС.

Хорошо известно, что активность ферментов, разрушающих фосфатированные соединения, включая АТФ, присутствует в крови [16]. Мы могли не обнаружить PRPP, АТФ и NMN в плазме крови, потому что они быстро разлагались ферментами во время приготовления плазмы.Чтобы проверить эту возможность, мы исследовали стабильность PRPP, ATP и NMN в плазме. Как показано на фиг. 3, эти соединения не подвергались значительному разложению в плазме в течение по крайней мере 20 мин в присутствии EDTA / EGTA при 4 ° C, условиях, используемых для приготовления плазмы. После инкубации даже при 37 ° C они были в значительной степени защищены от разложения (рис. 3). В отличие от этого, PRPP и АТФ быстро разлагались в плазме без добавления хелаторов (рис. 3). NMN также разлагался в отсутствие хелаторов при 37 ° C, но медленнее, чем PRPP или ATP (рис.3). Эти результаты показывают, что хотя PRPP, АТФ и NMN разлагаются в плазме, эти соединения стабильны, если в плазме поддерживается температура 4 ° C в присутствии хелаторов, и, таким образом, невозможность обнаружения этих соединений в плазме не связана с к их деградации во время приготовления плазмы.

Рисунок 3. PRPP, АТФ и NMN разлагаются в плазме крови мышей.

PRPP, ATP или NMN (150, 300 или 60 пмоль соответственно) инкубировали с плазмой крови (30 мкл) в присутствии EDTA / EGTA при 4 ( кружков, ) или 37 ° C ( треугольников). ) или в отсутствие хелаторов при 37 ° C ( квадратов ) в течение указанного времени.После инкубации определяли количества PRPP (A), ATP (B) и NMN (C), оставшиеся в каждый момент времени в плазме, и выражали их как процент от количества через 0 мин.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022781.g003

Из всех этих наблюдений мы заключаем, что в плазме крови мышей, хотя Nam присутствует, PRPP и ATP почти отсутствуют. В совокупности с гораздо более низкими концентрациями Nam и PRPP в плазме по сравнению с их внутриклеточными уровнями и низким сродством NAMPT к субстратам в отсутствие АТФ, NAMPT не должен эффективно катализировать свою реакцию в плазме.

NAMPT не образует NMN в плазме крови

Чтобы непосредственно проверить приведенное выше понятие, мы инкубировали NAMPT с плазмой и определяли образование NMN. Даже когда NAMPT был инкубирован с плазмой при 25 мкг / мл, концентрация в 10 тысяч раз выше, чем в плазме крови (1-3 нг / мл) [24], [25], образование NMN не наблюдалось ( n = 3). Однако при дальнейшем добавлении PRPP (30 мкМ) вместе с АТФ (1 мМ) в реакции (0.42 ± 0,07 мкМ, n = 3). Когда к плазме добавляли только PRPP (30 мкМ) вместе с NAMPT, образования NMN не наблюдалось ( n = 3), подтверждая существенную потребность в АТФ для реакции NAMPT. В этих условиях PRPP оставался в плазме в концентрации 3,2 ± 0,6 мкМ ( n = 3). Эти наблюдения показывают, что NAMPT не катализирует реакцию NAMPT в плазме без добавления PRPP и ATP.

Discussion

NAMPT — это ограничивающий скорость фермент, катализирующий первую стадию синтеза НАД в клетках млекопитающих [1].Сообщается, что циркулирующий NAMPT, также известный как висфатин, оказывает множество действий [8] — [11], [15]. Было высказано предположение, что возможные внеклеточные действия висфатина опосредуются его активностью NAMPT [9], [11], [14], [15]. Однако сообщается, что внеклеточные пространства содержат мало или совсем не содержат АТФ [16]. Таким образом, мы задались вопросом, действительно ли висфатин катализирует образование NMN в такой внеклеточной среде. Чтобы ответить на этот вопрос, критически важно оценить потребность в АТФ для NAMPT как во внеклеточных, так и во внутриклеточных условиях.Используя очищенный рекомбинантный человеческий NAMPT, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что АТФ является важным активатором NAMPT при физиологических концентрациях субстратов PRPP и Nam.

Наш кинетический анализ показал, что миллимолярная концентрация АТФ увеличивает сродство NAMPT к Nam и PRPP. В частности, значение K _m для PRPP было намного выше, чем его внутриклеточная концентрация в отсутствие АТФ, тогда как в присутствии 1 мМ АТФ значение K _m снижалось до его внутриклеточной концентрации.В соответствии с кинетическими данными, NAMPT не проявлял значительной активности при внутриклеточных концентрациях субстратов без АТФ, тогда как фермент резко активировался в присутствии миллимолярных концентраций АТФ. Напротив, при достаточно высоких концентрациях субстратов активность NAMPT практически не зависела от присутствия АТФ. Эти результаты показывают, что миллимолярные уровни АТФ абсолютно необходимы для того, чтобы NAMPT проявлял значительную активность во внутриклеточной среде, тогда как, если доступны гораздо более высокие концентрации субстратов, нуклеотид не является существенным для активности фермента.Почти такая же потребность в АТФ была подтверждена для человеческого NAPRT. Исследование мутагенеза идентифицировало His-213 как возможную детерминанту активации NAPRT под действием АТФ. Недавно о подобном влиянии АТФ на реакцию NAMPT сообщили Бургос и Шрамм [26].

Мы впервые представили концентрации АТФ, которые вызывают полумаксимальную стимуляцию ( K _a ) в реакциях NAMPT и NAPRT в физиологических условиях (рис. 2). Полученные значения K _a для АТФ NAMPT и NAPRT [341 ± 63 мкМ ( n = 5) и 395 ± 91 мкМ ( n = 3), соответственно] были намного выше, чем сообщаемые К. _m значений АТФ человеческих NMN / NaMN аденилилтрансферазы-1, -2 и -3 (59, 89 и 42 мкМ, соответственно) [27] и NAD-синтетазы (89 мкМ) [28], нижестоящих ферментов в синтезе вторсырья НАД [1] (рис.1). Сравнение этих кинетических данных показало, что NAMPT и NAPRT являются наиболее чувствительными ферментами к изменениям клеточных уровней АТФ при вторичном синтезе NAD. Таким образом, вероятно, что синтез НАД жестко регулируется на первых этапах пути клеточной концентрацией АТФ, и что, исходя из миллимолярных уровней нормального клеточного АТФ, эта регуляция может быть значительной во время значительного истощения пулов АТФ, например, во время клеточного стресса.

Была выдвинута гипотеза, что висфатин действует как внеклеточный NMN-образующий фермент, и образующийся NMN используется для внутриклеточного биосинтеза NAD после поглощения клетками [9], [11], [14], [15].Однако наше исследование предоставляет три линии доказательств, которые не поддерживают эту гипотезу. Во-первых, существенная потребность в АТФ для активности NAMPT не поддерживает NAMPT для катализирования образования NMN во внеклеточной среде. В плазме крови мышей, хотя субстрат Nam присутствовал в концентрации 4,6 мкМ, другой субстрат PRPP не обнаруживался, а активатор АТФ почти отсутствовал (1,3 мкМ). В совокупности с низким сродством NAMPT к субстратам в отсутствие активатора АТФ, а также с гораздо более низкими концентрациями субстратов в плазме крови по сравнению с их внутриклеточными уровнями, NAMPT не должен эффективно катализировать свою реакцию в плазме.Во-вторых, мы обнаружили, что PRPP быстро разлагается в плазме. Поскольку добавление EDTA / EGTA к плазме ингибировало деградацию PRPP, щелочные фосфатазы с широкой субстратной специфичностью по отношению к различным фосфатированным соединениям и требованием ионов металлов для активности фермента [16] могут, по крайней мере, частично катализировать деградацию. Сильная активность фермента, разрушающего PRPP в плазме, а также сообщаемый короткий период полужизни АТФ во внеклеточной среде [16], [29], подтвержденный в этом исследовании, исключает возможность того, что внеклеточные концентрации PRPP и АТФ могут поднимаются достаточно высоко, чтобы поддерживать синтез NMN, например, в микросреде поврежденных клеток.В-третьих, добавленный к плазме NAMPT не катализирует образование NMN. Невозможность определить активность NAMPT не была связана с небольшим количеством добавленного фермента или инактивацией фермента в плазме, поскольку фермент был добавлен в плазму в концентрации, в 10 тысяч раз превышающей концентрацию в плазме крови [24]. , [25] и значительное количество NMN было произведено добавлением PRPP и ATP. Эти результаты показывают, что NAMPT не катализирует свою реакцию в плазме из-за чрезвычайно низких концентраций PRPP и ATP.Таким образом, NAMPT не участвует в образовании NMN в такой внеклеточной среде. Все три линии доказательств, представленных здесь, указывают на то, что внеклеточный висфатин не может рассматриваться как фермент, способный синтезировать NMN.

Мы не обнаружили NMN в плазме даже с помощью высокоспецифичного и чувствительного метода ЖХ / МС / МС [18], который может количественно определить NMN, если мононуклеотид присутствует в концентрации не менее 50 нМ. Невозможность обнаружить NMN в плазме не связана с его деградацией во время приготовления плазмы, поскольку нуклеотид был стабильным в условиях, используемых для приготовления плазмы.В отличие от настоящего результата, предыдущие исследования показали, что концентрация NMN в плазме крови составляет 80–90 мкМ [9], а в культуральной среде мышечных клеток — 300 мкМ [15], с использованием анализа ВЭЖХ с детектированием УФ-поглощения. Сообщаемые высокие внеклеточные концентрации NMN могут быть связаны с трудностью количественной оценки NMN с помощью анализа ВЭЖХ из-за чрезвычайно короткого времени элюирования [30].

В заключение, существенная потребность в АТФ для активности NAMPT и неспособность NAMPT, добавленного к плазме крови мыши, образовывать NMN, указывают на то, что внеклеточная среда с небольшим содержанием АТФ или без него не позволяет внеклеточному висфатину катализировать образование NMN in situ. .Кроме того, внеклеточные NMN не служат прямым предшественником внутриклеточного биосинтеза НАД [31]. В совокупности эти наблюдения не подтверждают концепцию «NAMPT-опосредованного системного биосинтеза NAD» [9], [14]. Присутствие висфатина в кровообращении может быть просто результатом гибели клеток [32], или даже если висфатин в плазме имеет физиологические функции, он может действовать независимо от его биосинтетической активности NMN [33]. Наше исследование поможет прояснить физиологическое значение внеклеточного NAMPT.

Благодарности

Благодарим К. Каваками за техническую помощь.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: NH MT. Выполнял эксперименты: NH KY TS. Проанализированы данные: NH KY TS HO ​​MT. Написал статью: NH MT.

Ссылки

1. 1. Magni G, Amici A, Emanuelli M, Raffaelli N, Ruggieri S (1999) Энзимология синтеза NAD ⁺ . Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 73: 135–182.
2. 2.Дитрих Л.С., Фуллер Л., Йеро И.Л., Мартинес Л. (1966) Активность никотинамидмононуклеотидпирофосфорилазы в тканях животных. J Biol Chem 241: 188–191.
3. 3. Elliott GC, Rechsteiner MC (1982) Доказательства физиологически активной никотинамидфосфорибозилтрансферазы в культивируемых фибробластах человека. Biochem Biophys Res Commun 104: 996–1002.
4. 4. Смит Л.Д., Голсон Р.К. (1969) Аллостерические свойства никотинатфосфорибозилтрансферазы бычьей печени.J Biol Chem 244: 68–71.
5. 5. Нидель Дж, Дитрих Л.С. (1973) Никотинатфосфорибозилтрансфераза эритроцитов человека. ОЧИЩЕНИЕ И СВОЙСТВА. J Biol Chem 248: 3500–3505.
6. 6. Хаякава Т., Сибата К., Иваи К. (1984) Никотинатфосфорибозилтрансфераза из печени свиньи: регулирующий эффект АТФ при физиологических концентрациях 5-фосфорибозил-1-пирофосфата. Agric Biol Chem 48: 455–460.
7. 7. Самал Б., Сан Й., Стернс Дж., Се С., Саггс С. и др.(1994) Клонирование и характеристика кДНК, кодирующей новый фактор увеличения колоний человеческих пре-В-клеток. Mol Cell Biol 14: 1431–1437.
8. 8. Фукухара А., Мацуда М., Нисидзава М., Сегава К., Танака М. и др. (2005) Висфатин: белок, секретируемый висцеральным жиром, имитирующий действие инсулина. Наука 307: 426–430.
9. 9. Револло Дж. Р., Кёрнер А., Миллс К. Ф., Сато А., Ван Т. и др. (2007) Nampt / PBEF / Visfatin регулирует секрецию инсулина в β-клетках как системный фермент биосинтеза НАД.Cell Metab 6: 363–375.
10. 10. Moschen AR, Kaser A, Enrich B, Mosheimer B, Theurl M и др. (2007) Висфатин, адипоцитокин с провоспалительными и иммуномодулирующими свойствами. J Immunol 178: 1748–1758.
11. 11. Ромачо Т., Ацкутия В., Васкес-Белла М., Матесанц Н., Серкас Е. и др. (2009) Внеклеточный PBEF / NAMPT / висфатин активирует провоспалительную передачу сигналов в гладкомышечных клетках сосудов человека за счет активности никотинамидфосфорибозилтрансферазы.Диабетология 52: 2455–2463.
12. 12. Sommer G, Garten A, Petzold S, Beck-Sickinger AG, Blüher M и др. (2008) Visfatin / PBEF / Nampt: структура, регуляция и потенциальная функция нового адипокина. Clin Sci 115: 13–23.
13. 13. Garten A, Petzold S, Körner A, Imai S, Kiess W (2009) Nampt: соединение биологии, метаболизма и рака NAD. Тенденции метаболизма эндокринола 20: 130–138.
14. 14. Имаи С. (2009) Мир НАД: новая системная регуляторная сеть для метаболизма и старения — Sirt1, системный биосинтез НАД и их важность.Cell Biochem Biophys 53: 65–74.
15. 15. Ван П., Сюй Т.Ю., Гуань Ю.Ф., Су Д.Ф., Фан Г.Р. и др. (2009) Висфатин, полученный из периваскулярной жировой ткани, является фактором роста гладкомышечных клеток сосудов: роль никотинамидмононуклеотида. Cardiovasc Res 81: 370–380.
16. 16. Егуткин Г.Г. (2008) Нуклеотид- и нуклеозид-превращающие эктоферменты: важные модуляторы пуринергического сигнального каскада. Biochim Biophys Acta 1783: 673–694.
17. 17. Хара Н, Ямада К., Шибата Т., Осаго Х., Хашимото Т. и др.(2007) Повышение клеточных уровней НАД никотиновой кислотой и участие фосфорибозилтрансферазы никотиновой кислоты в клетках человека. J Biol Chem 282: 24574–24582.
18. 18. Ямада К., Хара Н., Шибата Т., Осаго Х., Цучия М. (2006) Одновременное измерение никотинамидадениндинуклеотида и родственных соединений с помощью тандемной масс-спектрометрии жидкостной хроматографии / ионизации с электрораспылением. Анальная биохимия 352: 282–285.
19. 19. Sauve AA, Moir RD, Schramm VL, Willis IM (2005) Химическая активация Sir2-зависимого сайленсинга путем облегчения ингибирования никотинамида.Mol Cell 17: 595–601.
20. 20. Rosenbloom FM, Henderson JF, Caldwell IC, Kelley WN, Seegmiller JE (1968) Биохимические основы ускоренного биосинтеза пурина de novo в человеческих фибробластах, лишенных гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы. J Biol Chem 243: 1166–1173.
21. 21. Кавагути Т., Вич Р.Л., Уеда К. (2001) Регулирование энергетического метаболизма в макрофагах во время гипоксии: РОЛИ ФРУКТОЗА 2, 6-БИСФОСФАТА и РИБОЗЫ 1,5-БИСФОСФАТА.J Biol Chem 276: 28554–28561.
22. 22. Gross J, Rajavel M, Segura E, Grubmeyer C (1996) Энергетическая связь в фосфорибозилтрансферазе никотиновой кислоты Salmonella typhimurium : идентификация His-219 как сайта фосфорилирования. Биохимия 35: 3917–3924.
23. 23. Катц П., Шинн В., Капетанович И.М., Ким Х., Ким М. и др. (2005) Одновременное определение миристилникотината, никотиновой кислоты и никотинамида в плазме кроликов методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии с использованием метилэтилкетона в качестве растворителя для депротеинизации.J Chromatogr B 829: 123–135.
24. 24. Körner A, Garten A, Blüher M, Tauscher R, Kratzsch J, et al. (2007) Молекулярные характеристики висфатина сыворотки и дифференциальное определение с помощью иммуноанализов. J Clin Endocrinol Metab 92: 4783–4791.
25. 25. Retnakaran R, Youn BS, Liu Y, Hanley AJ, Lee NS и др. (2008) Корреляция циркулирующего полноразмерного висфатина (PBEF / NAMPT) с метаболическими параметрами у субъектов с диабетом и без него: перекрестное исследование.Clin Endocrinol 69: 885–893.
26. 26. Burgos ES, Schramm VL (2008) Слабая связь гидролиза АТФ с химическим равновесием никотинамидфосфорибозилтрансферазы человека. Биохимия 47: 11086–11096.
27. 27. Сорчи Л., Чимадамор Ф., Скотти С., Петрелли Р., Каппеллаччи Л. и др. (2007) Кинетика начальной скорости человеческих NMN-аденилилтрансфераз: специфичность к субстратам и ионам металлов, ингибирование продуктами и мультисубстратными аналогами, а также вклад изоферментов в биосинтез NAD ⁺ .Биохимия 46: 4912–4922.
28. 28. Хара Н., Ямада К., Терашима М., Осаго Х., Симояма М. и др. (2003) Молекулярная идентификация человеческих глутамин- и аммиак-зависимых NAD-синтетаз: Углеродно-азотный гидролазный домен вызывает глутаминовую зависимость. J Biol Chem 278: 10914–10921.
29. 29. Bours MJ, Swennen EL, Di Virgilio F, Cronstein BN, Dagnelie PC (2006) Аденозин-5′-трифосфат и аденозин как эндогенные сигнальные молекулы при иммунитете и воспалении.Pharmacol Ther 112: 358–404.
30. 30. Formentini L, Moroni F, Chiarugi A (2009) Обнаружение и фармакологическая модуляция никотинамидмононуклеотида (NMN) in vitro и in vivo . Biochem Pharmacol 77: 1612–1620.
31. 31. Никифоров А., Дёлле С., Ньер М., Зиглер М. (2011) Пути и субклеточная компартментация биосинтеза NAD в клетках человека: ОТ ВСТУПЛЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРЕДШЕСТВИЙ ДО МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ГЕНЕРАЦИИ NAD. J Biol Chem 286: 21767–21778.
32. 32. Stephens JM, Vidal-Puig AJ (2006) Обновленная информация о висфатине / пре-B-клеточном колоние-увеличивающем факторе, повсеместно экспрессируемом, иллюзорном цитокине, который регулируется при ожирении. Curr Opin Lipidol 17: 128–131.
33. 33. Ли И, Чжан И, Дорвейлер Б., Цуй Д., Ван Т. и др. (2008) Extracellular Nampt способствует выживанию макрофагов посредством неферментативного механизма передачи сигналов интерлейкина-6 / STAT3. J Biol Chem 283: 34833–34843.

Складная детская кроватка Osage River — невероятная цена

Osage River Folding Camp Cot — это раскладушка для быстрой установки, не требующая сборки, прочная стальная конструкция по невероятной цене.