Мы идентифицировали связанный с вибриоферрином рецептор (psuA) и гены биосинтеза (pvsABCDE) ³³ во всех геномах Azotobacter, доступных в Genbank ( A. beijerinckii, штаммы DSM 1041, DSM 378, DSM 373, DSM 282 gen, DSM 381 draft версии по состоянию на июль 2018 г., AC-8003, AC-B3 и A. vinelandii CA, таблица S3, ESI † и рис. 2D). Филогенетический анализ белков биосинтеза вибриоферрина в конкатенированной форме (PvsABCDE, рис.2А) показывают, что последовательности из штаммов одного вида группируются вместе. Этот эволюционный паттерн кластеризации и сохранение в геномном контексте (рис. 2A) типичны для генов, которые наследуются вертикально (, например, 16S рРНК, рис. 2D), и составляют «основной» геном вида. ³⁴ Помимо видоспецифичных групп, кластеры генов вибриоферрина из разных видов Azotobacter образуют сильно поддерживаемую кладу (рис. 2A, последовательности в сером прямоугольнике), отделенные от кластеров генов в Pseudomonas , Xanthomonas , Marinobacter и Vibrio видов.Данные предполагают, что (а) вибриоферрин является основным вторичным метаболитом для видов Azotobacter и (б) способность вырабатывать это соединение является древней, поскольку поддерживается посредством вертикального переноса генов с момента расхождения предковых азотобактеров с современными видами. линии (рис. 3). Действительно, недавний анализ геномов Vibrio также выявил древнее происхождение генов вибриоферрина в линии Vibrio . ³⁵

Амфибактины и крохелины: древние и новые сидерофоры, кодируемые горячей точкой рекомбинации

Амфибактины, впервые описанные у морских бактерий, ³⁶ происходят из ферментов NRPS ( e.грамм. , кодируемый ABO_2093, ABO_2092 в связанной с маслом морской бактерии ( Alkanivorax borkumensis SK2 ^36–38 ). Четыре полных модуля удлинения конденсация-аденилирование-тиолирование кодируют ступенчатую сборку аминокислот (Орн-Орн-Сер-Орн) в головную группу пептидного амфибактина. ³⁸ Гены NRPS амфибактина обычно окружены генами, отвечающими за регуляцию, транспорт и адаптацию сидерофоров (pvdA-подобная l-орнитин-моноксигеназа, iucB-подобная ацетилтрансфераза, рис.1B и рис. S1, ESI †). Помимо AC-8003 и AC-B3 (рис. 1B), мы идентифицировали кластеры амфибактина в каждом секвенированном штамме A. beijerinckii , но не A. vinelandii str. CA (рис. 2B и D).

Филогенетический анализ конкатенированных белков NRPS амфибактина показывает закономерности кластеризации, которые предполагают более сложную эволюционную историю амфибактинов по сравнению с вибриоферринами, поскольку последовательности из одних и тех же видов Azotobacter не всегда группируются вместе ( i.е. Последовательности AC-8003 и AC-B3 не образуют кладу, за исключением A. beijerinckii , фиг. 2B). Хотя это не так ясно, как для филогении биосинтеза вибриоферрина, сигналы для вертикального наследования генов продукции амфибактина присутствуют. Последовательности из различных видов Azotobacter группируются вместе, отдельно от последовательностей из других родов, образуя большую кладу амфибактина Azotobacter (последовательности на фиг. 2B в сером прямоугольнике). Этот филогенетический паттерн предполагает, что некоторый вертикальный перенос генов кластера амфибактина должен был произойти во время видообразования Azotobacter .Более того, внутри этого большого кластера подкластеры, которые хорошо поддерживаются (узлы с высокими значениями начальной загрузки), включают только штаммы одного и того же вида ( A. beijerincki DSM 1041 и 373; DSM 282 и 381). Наконец, вертикальное наследование отражается в контексте консервативных генов у разных видов (рис. 2B, штаммы AC-B3 и A. beijerinckii ), где гены кластера амфибактина на хромосоме фланкируются генами созревания гидрогеназы и транспорта сидерофоров (hypABFCDE и fhuBDC соответственно, рис.2Б).

Интересно, что кластер амфибактина AC-8003 вложен между двумя генами транспозаз (Achr_f2120 и Achr_f2210, рис. 1) на мегаплазмиде ∼300 kb (pAcX50f) в отличие от генов амфибактина у других видов Azotobacter . Гомологичный участок хромосомы AC-8003, который кодирует амфибактины в штаммах AC-B3 и A. beijerinckii , вместо этого содержит псевдоген NRPS с одним доменом эпимеризации (E), за которым следует большой кластер cro для крохелина A. синтез (рис.2С). Псевдоген NRPS также присутствует в гомологичной области хромосомы A. vinelandii CA (рис. 2C).

Основываясь на контексте генов и филогенетических данных, мы предлагаем эволюционный сценарий, в котором гены амфибактина изначально были локализованы на хромосоме предкового вида Azotobacter , геном которого состоял из репликонов хромосомы и плазмиды (рис. 3). Вертикальное наследование во время видообразования может объяснить продолжающееся присутствие генов амфибактина в хромосоме AC-B3 и A.beijerinckii штамм. Расположенные в хромосоме гены амфибактина при помощи фланкирующих транспозаз (рис. 2B, Achr_f2120, Achr_f2210) могли затем рекомбинировать в плазмиду в линии AC-8003, что объясняет кодируемые плазмидой амфибактины на AC-8003 (рис. 3). Рекомбинация новых генов NRPS (кодирующих крохелин) в область рядом с богатым NRPS локусом хромосомы амфибактина в линии AC-8003 (рис. 3) также должна была произойти для объяснения ближайшего местоположения кластеров генов хромосом крохелина и амфибактина. (Инжир.2С). Дополнительным доказательством, согласующимся с перемещением генов амфибактина от хромосомы к плазмиде (рис. 2D), является отсутствие как генов амфибактина, так и плазмид у A. vinelandii . Это можно объяснить потерей плазмиды у предка A. vinelandii после рекомбинации гена амфибактина в плазмиду (как в AC-8003) (рис. 3). Наконец, наличие локуса биосинтеза амфибактина на наследственной хромосоме всех видов Azotobacter также подтверждается присутствием псевдогена NRPS в AC-8003 и A.vinelandii хромосом. Хотя рекомбинация в области хромосомы, богатой NRPS, помогает объяснить биосинтез амфибактина и крохелина, горизонтальный перенос генов, вероятно, также привел к появлению генов биосинтеза сидерофоров в других местах хромосомы (, например, для катехинов и азотобактина в A .vinelandii , рис. 3).

В качестве альтернативы кластер амфибактина мог быть первоначально закодирован на плазмиде предкового вида Azotobacter , при этом текущее распределение генов сформировано смесью вертикального наследования плазмиды (при этом гены амфибактина на основе плазмиды AC-8003 представляют собой древний локус), рекомбинация плазмиды / хромосомы и потеря плазмиды из разных линий.Однако два отдельных события рекомбинации (каждое из которых перемещает гены амфибактина из плазмиды в одно и то же место хромосомы) должны были произойти, чтобы объяснить, почему гены амфибактина AC-B3 и A. beijerinckii не образуют кластер для исключение AC-8003, но все еще содержат консервативные генные контексты. Наконец, в этом альтернативном сценарии потеря плазмиды из линии A. vinelandii приведет к отсутствию амфибактинов в A. vinelandii CA.Основываясь на более быстрой эволюции плазмидных последовательностей по сравнению с хромосомными генами, ³⁹ мы считаем этот сценарий менее вероятным. Несмотря на это, правдоподобные сценарии эволюции амфибактина должны включать вертикальный перенос генов, а также прирост и потерю генов посредством гомологичной рекомбинации.

Генетическая рекомбинация в богатых NRPS областях бактериальных геномов, при помощи мобильных генетических элементов и приводящая к потере и усилению генов, может привести к перемещению целых локусов биосинтеза сидерофоров между репликонами ^40–42 ( e.грамм. на плазмиду в AC-8003) и объясните новые локусы, которые кодируют совершенно новые сидерофоры, ⁴³ , такие как Crochelin A. Учитывая близость хромосомных локусов для амфибактинов, крохелинов и транспозаз, разнообразие сидерофоров в Azotobacter , по-видимому, соответствует сильно облегчаться за счет «смешения и сопоставления» кластеров генов натуральных продуктов. ⁴³ Действительно, анализ генома AC-8003 ² показал большое количество транспозаз, которые могут способствовать перемещению ДНК внутри и между геномами.

Анализ структур сидерофоров

Результатом эволюции гена сидерофоров является сохранение генов низкоаффинного сидерофорного вибриоферрина у всех видов Azotobacter . Гены, кодирующие амфибактин-подобные сидерофоры, обнаруживаются только в штаммах AC, но не в штаммах AV, которые вместо этого используют группу катехолидерофоров и азотобактинов (рис. 2D). Похоже, что Crochelin производится только на AC-8003. Чтобы изучить продукты сидерофоров из этих кластеров генов, мы использовали ЖХ-МС высокого разрешения для скрининга характерного паттерна стабильных изотопов ⁵⁴ Fe– ⁵⁶ Fe, связанного с хелатами Fe, и точной разницы масс между апо — и Fe. -связанные формы, как описано ранее (рис.S2, ESI †). ¹⁶ Мы также провели поиск в данных ЖХ-МС / МС с высоким разрешением на предмет характерных для сидерофоров фрагментации. ³¹ Мы ранее сообщали о сидерофорах, продуцируемых AC-8003, уделяя особое внимание крохелинам как новому семейству сидерофоров. ¹⁸ Здесь мы предоставляем подробный анализ набора новых гидрофильных амфибактинов в супернатантах AC-8003 и представляем первый анализ сидерофоров AC-B3. Затем мы нацелены на идентифицированные сидерофоры, чтобы количественно оценить их продукцию в условиях высокой, средней и низкой доступности Fe (рис.6).

(i) Вибриоферрин: оба штамма AC продуцировали вибриоферрин А в качестве основного продукта, связанного с кластером генов вибриоферрина (рис. 4). Структура вибриоферрина A была подтверждена сравнением m / z , времени удерживания и фрагментации МС / МС с изолированным стандартом (рис. S3, ESI †).

Рис. 4

Сравнение хроматограмм экстрагированных ионов основных идентифицированных сидерофоров, обнаруженных в отработанной среде AC-B3 (панель A) и AC-8003 (панели B и C) во время позднего экспоненциального роста в среде Берка с ограничением Fe (5 мкМ Fe, 100 мкМ ЭДТА).Оба штамма продуцируют вибриоферрин и набор растворимых гидрофильных амфибактинов (основные продукты с длинами хвостов жирных кислот C10, C12, C14, см. Рис. 5). Штамм AC-8003 составляет дополнительную головную группу амфибактина. Основной продукт AC-8003, положительно заряженный гидрофильный крохелин A, наблюдается только после добавления сильного ионно-парного реагента к буферу подвижной фазы (гептафтормасляная кислота, HFBA), как показано на панелях B и C. описанные липопетидные предшественники крохелина А также наблюдались в среде (длина цепи жирных кислот C10 и C12, см. рис.5 для конструкций). Таблицы с подробными результатами ЖХ-МС для всех обнаруженных сидерофоров можно найти в ESI † (Таблицы S8 – S10).

Рис. 4

Сравнение хроматограмм экстрагированных ионов основных идентифицированных сидерофоров, обнаруженных в отработанных средах AC-B3 (панель A) и AC-8003 (панели B и C) во время позднего экспоненциального роста в среде Берка с ограничением Fe (5 мкМ Fe, 100 мкМ ЭДТА). Оба штамма продуцируют вибриоферрин и набор растворимых гидрофильных амфибактинов (основные продукты с длиной хвоста жирных кислот C10, C12, C14, см. Рис.5). Штамм AC-8003 составляет дополнительную головную группу амфибактина. Основной продукт AC-8003, положительно заряженный гидрофильный крохелин A, наблюдается только после добавления сильного ионно-парного реагента к буферу подвижной фазы (гептафтормасляная кислота, HFBA), как показано на панелях B и C. описанные липопетидные предшественники крохелина А также наблюдались в среде (длина цепи жирных кислот C10 и C12, см. структуры на фиг. 5). Таблицы с подробными результатами ЖХ-МС для всех обнаруженных сидерофоров можно найти в ESI † (Таблицы S8 – S10).

(ii) Амфибактины: оба штамма AC продуцировали несколько аналогов растворимых амфибактинов, обнаруженных в супернатантах культур (рис. 4, 5 и таблица S8, ESI †). Экстракты осадка клеток также содержали небольшие количества более гидрофобных аналогов амфибактина (таблица S9, ESI †). Один из аналогов амфибактина, продуцируемый AC-B3, соответствует по массе, времени удерживания и МС / МС-фрагментации стандарту амфибактина S (жирнокислотный хвост C14: 1), сидерофор, о котором ранее сообщалось у морских видов Vibrio (рис.S4, ESI †). Другая структура соответствует амфибактину Т (насыщенный хвост C12: 0). ³⁶ Помимо амфибактинов S и T, мы выделили несколько новых гидрофильных амфибактинов и количественно определили их концентрации с помощью 1H-ЯМР-спектроскопии (рис. S5, ESI †). Были идентифицированы два основных новых аналога с жирно-ацильными группами 3-гидроксидеканоила ( 4 , амфибактин ACA) и деканоила ( 6 , амфибактин ACB) (рис. 5). Дополнительные аналоги были обнаружены с длиной цепи C10 – C14 жирно-ацильных групп.Хвосты жирных кислот были полностью насыщенными, содержали одну двойную связь или одну гидроксильную группу. Штамм AC-8003 секретировал головную группу амфибактина без жирнокислотного хвоста (рис. 4 и 5), что предположительно возникло из-за активности фермента гидролазы жирных кислот, связанного с кластером крохелина (CroM, см. Также раздел крохелин ниже). Незначительные дополнительные пики, соответствующие более гидрофобным аналогам, были обнаружены в экстрактах клеточного осадка, включая соединения, соответствующие ранее описанному амфибактину D (C14: 0 жирно-ацильная группа) и амфибактину E (C16: 1). ^36,38,44 Подробный список всех обнаруженных амфибактинов и сравнение относительных содержаний AC-8003 и AC-B3 см. В таблицах S8 – S10 (ESI †).

Рис. 5

Сидерофорные структуры из AC-8003 и AC-B3. Вибриоферрин, амфибактины и крохелины были идентифицированы путем сравнения времени удерживания и спектров МС и МС / МС высокого разрешения со стандартами. Оба штамма продуцировали набор новых гидрофильных амфибактинов с короткоцепочечными жирными кислотными хвостами (C10, C12 для AC-8003 и C10, C12, C14 для AC-B3).Два новых амфибактина были выделены для количественной оценки и характеристики ЯМР (амфибактин ACA и ACB). Другие новые гидрофильные аналоги амфибактина имели ту же головную группу, но разные хвосты жирных кислот, как показали анализы МС / МС с высоким разрешением. Подробные результаты ЖХ-МС можно найти в ESI † (Таблицы S8 – S10).

Рис. 5

Сидерофорные структуры из AC-8003 и AC-B3. Вибриоферрин, амфибактины и крохелины были идентифицированы путем сравнения времени удерживания и спектров МС и МС / МС высокого разрешения со стандартами.Оба штамма продуцировали набор новых гидрофильных амфибактинов с короткоцепочечными жирными кислотными хвостами (C10, C12 для AC-8003 и C10, C12, C14 для AC-B3). Два новых амфибактина были выделены для количественной оценки и характеристики ЯМР (амфибактин ACA и ACB). Другие новые гидрофильные аналоги амфибактина имели ту же головную группу, но разные хвосты жирных кислот, как показали анализы МС / МС с высоким разрешением. Подробные результаты ЖХ-МС можно найти в ESI † (Таблицы S8 – S10).

(iii) Крохелины: помимо вибриоферрина и амфибактинов, штамм AC-8003 также продуцировал крохелины — сидерофоры, синтезируемые кластером c ro . ¹⁶ Мы ранее охарактеризовали крохелин А из AC-8003, сидерофор со смешанными хелатирующими группами, которые включают новый Fe-хелатирующий фрагмент амино-дигидроксипентановую кислоту (ADPA). ¹⁶ Биосинтез крохелина А включает производство предшественников липопептидов с жирным ацильным хвостом, связанным с концевым свободным амином в ADPA (фиг. 5). Во время созревания крохелина А до активного сидерофора жирная ацильная группа отщепляется гидролазой (CroM). Мы обнаружили, что крохелин А является основным продуктом в отработанной среде с относительно незначительным вкладом нескольких предшественников крохелина А (<10% от концентрации крошелина А, рис.4С). Липопептидные предшественники, родственные крохелину A, имели жирные ацильные цепи, идентичные таковым в амфибактинах (основные аналоги с длиной углеродной цепи C10 и C12 с полным насыщением, одиночной ненасыщенностью или гидроксилированием, рис. 5).

Как упоминалось выше, головная группа амфибактина (без жирного ацильного хвоста) наблюдалась только в культурах AC-8003. Этот организм также кодирует ацилазу жирных кислот CroM как часть кластера биосинтеза крохелина, предполагая, что продукция головной группы амфибактина может быть результатом гидролиза хвостов жирных кислот из амфибактинов с помощью CroM из-за неразборчивости субстрата.

Функция сидерофоров: производство, доступность Fe и возможные синергетические эффекты

Чтобы лучше понять функцию вибриоферрина, амфибактинов и крохелина A, мы измерили рост и продукцию сидерофоров AC-8003 и AC-B3 с различными уровнями доступности Fe: (A) осажденные аморфные оксиды Fe (без добавления EDTA) для высоких Доступность Fe, (B) 5 мкМ Fe с 100 мкМ EDTA для промежуточной доступности Fe и (C) 0,1 мкМ Fe с 100 мкМ EDTA для низкой доступности Fe (рис.6). Эти условия применялись в предыдущем исследовании продукции сидерофоров A. vinelandii . ¹⁴ В соответствии с возрастающей строгостью ограничения Fe от условия A до состояния C, мы наблюдали более медленные темпы роста и урожайность для AC-8003 (рис. S6, ESI †). Соответственно, измерения концентраций растворенного Fe в отработанной среде AC-8003 показали, что условие A было связано с растворением Fe во время экспоненциального роста, достигая ~ 12 мкМ Fe (без EDTA) при более высоких оптических плотностях.Напротив, условие B показало медленное снижение концентраций растворенного Fe (первоначально добавленного в виде 5 мкМ Fe и 100 мкМ EDTA), что указывало на медленное поглощение Fe в присутствии EDTA. Условия C (первоначально добавленные в виде 0,1 мкМ Fe и 100 мкМ EDTA) имели концентрации Fe постоянно ниже предела обнаружения (<0,1 мкМ) (рис. S7, ESI †). Продукция сидерофоров при низкой плотности клеток (OD _{620 нм,} ∼0,1) увеличивалась от условия A до C (условие A, общая концентрация сидерофоров = 0,6 мкМ при OD _{620 нм} = 0.13; B, общая концентрация сидерофоров = 4,4 мкМ при OD _{620 нм} = 0,08; C, общая концентрация сидерофоров = 25,2 мкМ при OD = 0,08). AC-B3 и A. vinelandii ¹⁴ показали аналогичный экспоненциальный рост в условиях A и B и медленный линейный рост в условиях C. Объединенные наблюдения AC-8003, AC-B3 и A. vinelandii ¹⁴ отражают снижение биодоступности Fe от состояния A до C.

Рис. 6

Концентрации вибриоферрина, амфибактинов и крохелина А, секретируемых AC-8003 и AC-B3, при различной доступности Fe.(A) Высокая доступность Fe, на что указывает быстрый рост и высокая оптическая плотность в среде с аморфными оксидами Fe (без добавления EDTA). (B) Промежуточная доступность Fe, на что указывает более медленный рост в среде с 5 мкМ Fe с избытком ЭДТА (100 мкМ). (C) Низкая доступность Fe (строгое ограничение по Fe), на что указывает медленный неэкспоненциальный рост и низкие оптические плотности в среде с 0,1 мкМ Fe и 100 мкМ EDTA. Для сравнения показана продукция сидерофоров A. vinelandii OP ¹⁴ при тех же обработках Fe.Соответствующие оптические плотности и общие концентрации растворенного железа показаны на рис. S6 и S7 (ESI †).

Рис. 6

Концентрации вибриоферрина, амфибактинов и крохелина А, секретируемых AC-8003 и AC-B3, при различной доступности Fe. (A) Высокая доступность Fe, на что указывает быстрый рост и высокая оптическая плотность в среде с аморфными оксидами Fe (без добавления EDTA). (B) Промежуточная доступность Fe, на что указывает более медленный рост в среде с 5 мкМ Fe с избытком ЭДТА (100 мкМ).(C) Низкая доступность Fe (строгое ограничение по Fe), на что указывает медленный неэкспоненциальный рост и низкие оптические плотности в среде с 0,1 мкМ Fe и 100 мкМ EDTA. Для сравнения показана продукция сидерофоров A. vinelandii OP ¹⁴ при тех же обработках Fe. Соответствующие оптические плотности и общие концентрации растворенного железа показаны на рис. S6 и S7 (ESI †).

Оба штамма AC продуцировали высокие концентрации вибриоферрина A, когда Fe было предоставлено в виде аморфных оксидов Fe ([вибриоферрин A] ≤ 91 мкМ для AC-8003 и 145 мкМ для AC-B3) или в виде 5 мкМ Fe в комплексе с EDTA ([вибриоферрин A] ] = 45 мкМ для AC-8003 и 695 мкМ для AC-B3), два условия представляют высокую и промежуточную биодоступность Fe ¹⁴ (рис.6). В случае AC-8003 выработка вибриоферрина подавлялась с более сильным ограничением Fe в условиях B и C (рис. 6). В отличие от вибриоферина с низким сродством сидерофоров, общая концентрация сидерофоров с высоким сродством была низкой в ​​условиях A (<10 мкМ для AC-8003, <1 мкМ для AC-B3), затем увеличивалась в условиях B и C, когда Fe был менее доступны (36 мкМ для AC-8003, ~ 4-кратное увеличение и 11,3 мкМ для AC-B3, ~ 12-кратное увеличение, при 10-кратном снижении оптической плотности в состоянии C по сравнению с состоянием A) (рис.6).

Поскольку низкоаффинный сидерофорный вибриоферрин продуцируется даже при условии А (максимальная доступность Fe), мы хотели подтвердить его получение в ответ на ограничение Fe. Поэтому мы культивировали штаммы AC в среде с 5 мкМ, 0,5 мкМ или без добавления Fe в условиях, не связывающих азот (2 мМ NH ₄ ⁺ ) с более слабым хелатором NTA (log K = 15,9 ⁴⁵ ) вместо ЭДТА (log K = 25,1 ⁴⁵ ) и более низкой концентрации источника углерода (1 г л ^-1 для глюкозы и маннита вместо 10 г л ^-1 ).Такие условия могут привести к снижению выработки вибриоферрина из-за снижения потребности клеток в Fe и увеличения биодоступности Fe (NTA вместо EDTA). Действительно, продукция вибриоферрина была низкой или не определялась при добавлении 5 мкМ Fe в хелатной среде NTA (<0,5 мкМ) (рис. S8, ESI †). Когда концентрация Fe была снижена в той же среде до 0,5 мкМ, продукция вибриоферрина была значительной для обоих штаммов AC (4–6 мкМ). Когда Fe не добавлялось, продукция вибриоферрина снижалась в AC-8003, но не в AC-B3 (AC-8003, 1.6 мкМ; AC-B3, 10 мкМ), что согласуется с результатами условий от А до С, описанными выше. Для высокоаффинных сидерофоров, продуцируемых в NTA-хелатной среде (рис. S8, ESI †), мы наблюдали тенденции, аналогичные тем, которые наблюдались в условиях от A до C - увеличение концентрации высокоаффинных сидерофоров в среде с меньшим содержанием Fe (5 мкМ, 0,5 мкМ, без добавления общего Fe). С AC-8003 амфибактины и крохелины не обнаруживались при добавлении 5 мкМ Fe и увеличивались в ~ 1,5 и ~ 3 раза между условиями 0,5 мкМ Fe и без добавления Fe.При использовании AC-B3 амфибактины были обнаружены только в отсутствие добавленного Fe (3,7 мкМ) (рис. S8, ESI †).

Взятые вместе, эти результаты показывают согласованную картину для всех видов Azotobacter (A. chroococcum str. B-3, A. chroococcum str. NCIMB 8003 и A. vinelandii OP): вибриоферрин продуцировался на умеренное ограничение Fe, тогда как сидерофоры с высоким сродством использовались только при более жестком ограничении Fe. Совместное производство структур сидерофоров как с низким, так и с высоким сродством штаммами AC при умеренном и сильном ограничении Fe (рис.6B и C) ранее наблюдалась у A. vinelandii. Это может отражать «механизм ведра-бригады», посредством которого сидерофоры с низким и высоким сродством взаимодействуют синергетически, обеспечивая доступ бактерий к удаленным источникам Fe. ³⁶ Амфифильная природа сильных сидерофоров AC, амфибактинов и крохелинов может способствовать синергическому усвоению Fe: образование гидрофильных амфифильных сидерофоров может ускорять обмен Fe из EDTA, делая Fe доступным для мембраносвязанных вариантов амфифильных сидерофоров (Таблица S10, ESI †).Независимо от конкретных механизмов, с помощью которых взаимодействуют сидерофоры, способность создавать функционально различные сидерофоры имеет явные преимущества для бактерий, живущих в гетерогенных средах, таких как почвы, где биодоступность Fe может варьироваться в зависимости от минералогии, содержания и состава органических веществ, гидрологии, содержания кислорода и микробиологии. . Действительно, было показано, что использование множественных сидерофорных систем у отдаленно родственной почвенной бактерии, Pseudomonas aeruginosa , имеет решающее значение для ее выживания в средах с изменяющейся доступностью Fe. ⁴⁶ Учитывая доказательства того, что функционально избыточные сидерофоры теряются из микробных геномов, ⁴⁷ сохранение нескольких сидерофоров с разной силой связывания Fe в AC и других видах свидетельствует о вариабельности наличия Fe в естественной среде Azotobacter.

Заключение

Это исследование A. chroococcum , широко распространенного фиксатора N ₂ в почвах и обычного сельскохозяйственного инокулянта, показывает существование «основных» и клоноспецифичных сидерофоров в роде Azotobacter , которые выполняют различные функции в получении железа. .Продукция низкоаффинного сидерофорного вибриоферрина, вертикально наследуемого, консервативного признака физиологии Azotobacter , предпочтительна при умеренном ограничении клеточного Fe, тогда как клоноспецифичные сидерофоры с высоким сродством ( например, амфибактины, крохелины), которые происходят из генетическая рекомбинация, производятся, когда ограничение Fe становится более выраженным. Вместе с исследованиями A. vinelandii , ^14,23–27 эти результаты предполагают, что центральной характеристикой физиологии Azotobacter может быть способность продуцировать комбинацию низко- и высокоаффинных Fe-связывающих структур для оптимизации рост в диапазоне доступности Fe.

Экспериментальные методы

Бактериальные культуры

Дикий тип Штамм В3 Azotobacter chroococcum (штамм АТСС 7486) и штамм NCIMB 8003 (штамм АТСС 4412) выращивали в аэробных условиях в модифицированной среде Берка в диазотрофных условиях путем встряхивания при комнатной температуре, как описано ранее. ^14,48 Для анализа сидерофоров HR-LC-MS доступность Fe была ограничена добавлением 100 мкМ EDTA до 0.1 мкМ FeCl ₃ для AC-B3, тогда как концентрация 5 мкМ FeCl ₃ была добавлена ​​для достижения достаточного роста с AC-8003. Для изучения влияния источников Fe добавляли Fe в виде (1) 100 мкМ EDTA и 0,1 мкМ FeCl ₃ ; (2) 100 мкМ ЭДТА и 5 мкМ FeCl ₃ ; и (3) осажденные аморфные оксиды Fe. Рост бактерий контролировали при оптической плотности (OD) 620 нм (OD _{620 нм} ).

Анализ сидерофоров HR-LC-MS

Пробоподготовка

Аликвоты образцов для анализа сидерофоров HR-LC-MS были собраны на ранней стационарной фазе.Культуры центрифугировали, и супернатант и осадок клеток экстрагировали отдельно. Супернатант (20 мл) фильтровали (0,2 мкм), ультрафильтровали (Amicon Ultra 3kDa) и подкисляли 10 мкл трифторуксусной кислоты (TFA) перед экстракцией на картриджах твердофазной экстракции (SPE) C ₁₈ (свет C18, Вод). Колонку промывали 2,5 мл 0,1% муравьиной кислоты и элюировали 25% метанолом и 100% метанолом. Метанольные экстракты объединяли, сушили в SpeedVac (ThermoFisher) и восстанавливали 2 мл водной подвижной фазы.К одной аликвоте экстрактов относили концентрацию 100 мкМ FeCl ₃ , тогда как вторую аликвоту анализировали без добавления Fe (iii). Стерильную культуральную среду готовили таким же образом и использовали в качестве холостого опыта.

Осадки клеток, собранные из 30 мл культуры для AC-B3 и из 11 × 80 мл культур для AC-8003, экстрагировали в течение ночи в 20 мл метанола на шейкере при 4 ° C. Экстракты центрифугировали и метанольный экстракт фильтровали (0,2 мкм). Отфильтрованный экстракт затем сушили в SpeedVac и восстанавливали 25% метанолом для экстракции на колонке SPE с обращенной фазой (Oasis HLB Plus, Waters).Картридж SPE промывали 20 мл воды и элюировали 100% метанолом. Экстракт сушили в SpeedVac и повторно составляли 25% метанолом, добавленным в водный буфер, перед ЖХ-МС.

HR-LC-MS

HR-LC-MS был выполнен на платформе HPLC-MS с обращенной фазой с высокой точностью и разрешением с использованием колонки C18 (Agilent Eclipse Plus C18 3,5 мкм, 4,6 × 100 мм), соединенной с гибридной массой LTQ-Orbitrap XL. спектрометр (ThermoFisher). Введенные образцы (100 мкл) разделяли (30 мин) под градиентом растворов A и B (раствор A: вода + 0.1% ЖК + 0,1% уксусной кислоты; раствор Б: ацетонитрил + 0,1% ЖК + 0,1% уксусная кислота; градиент 0–100% B, расход 0,8 мл мин. ^-1 ). Масс-спектры полного сканирования были получены в режиме положительных ионов ( м / z = 145–1500) с разрешающей способностью R = 60 000 (на м / z = 400). Спектры МС / МС были одновременно получены с использованием CID в Orbitrap с использованием порога интенсивности родительских ионов> 10 000 и нацеливания либо на наиболее распространенные виды в спектре полного сканирования, либо на выборочно три наиболее распространенных вида в списке родительских ионов.

Обработка и анализ данных

Данные HR-LC-MS, полученные с экстрактами с поправками на Fe, были проверены на потенциальные сидерофоры с помощью (1) фильтрации по характеристике ⁵⁴ Fe– ⁵⁶ изотопных структур Fe, связанных с комплексами Fe, (2) поиска совместно элюируемых свободных лиганды и комплексы Fe по их точной разнице масс (Δ m (−3H ⁺ + Fe ³⁺ ) = 52.

Количественное определение сидерофоров

Для отслеживания концентраций сидерофоров в AC-B3 аликвоты проб объемом 1 мл были взяты в разное время в течение роста, отфильтрованы через 0.Шприцевые фильтры 2 мкм, подкисленные (0,1% уксусной кислоты и 0,1% муравьиной кислоты) и проанализированные путем прямого впрыска на одноквадрупольной системе ЖХ-МС (Agilent 6120). Анализ вибриоферрина и амфибактинов выполняли с помощью колонки C18 (Agilent Eclipse Plus C18 3,5 мкм, 4,6 × 100 мм) и градиента раствора A (вода + 0,1% ЖК + 0,1% уксусной кислоты) и B (ацетонитрил + 0,1% FA + 0,1% уксусная кислота; градиент от 0 до 100% A в течение 30 мин; скорость потока 0,8 мл мин. ^-1 ). Чтобы достичь достаточного удерживания на той же колонке C18, анализ крохелина A потребовал использования реагента ионной пары гептафтормасляная кислота (HFBA), добавляемого к растворам A (вода + 0.05% HFBA) и B (ацетонитрил + 0,05% HFBA) с градиентом от 0 до 100% A в течение 30 минут; расход 0,8 мл мин. ^-1 . Выход колонки был направлен в отходы в течение первых 5,25 мин, обеспечивая полное обессоливание образца перед введением в масс-спектрометр. Сидерофоры были количественно определены с помощью мониторинга одиночных ионов (SIM) с использованием списка целевых значений m / z идентифицированных сидерофоров из анализа HR-LC-MS (таблица S8, ESI †). Для количественного определения площади пиков ЖХ-МС были определены и преобразованы в концентрации путем калибровки с использованием стандартов вибриоферрина А, ¹⁶ амфибактинов АСА, S и Т (выделенных, как описано ниже, см.также рис.S5, ESI †) и крохелин A. ¹⁶ Семь технических реплик «стандарта» смеси отработанных сидерофоров со средой показали относительные стандартные отклонения <10% при концентрациях выше 0,5 мкМ. Предел обнаружения вибриоферрина А, амфибактинов и крохелина А в образце супернатанта находился в диапазоне от 0,02 до 0,10 мкМ.

Очистка амфибактинов

очищали для ЯМР-спектроскопического анализа и использовали в качестве стандарта очистки путем выращивания периодических культур (11 × 80 мл) на встряхивающем столе в условиях фиксации азота с помощью 100 мкМ ЭДТА и 5 мкМ FeCl ₃ .Это условие обеспечило экспоненциальный рост, который стал сильно ограничиваться Fe до достижения стационарной фазы, что привело к сильному производству амфибактинов. Инкубации объединяли по достижении стационарной фазы, центрифугировали и фильтровали (0,2 мкм). Супернатанты пропускали через смолы с обращенной фазой (Oasis HLB Plus), активировали метанолом (30 мл) и кондиционировали водой Milli-Q (30 мл). Картриджи промывали Milli-Q (30 мл) и неочищенные амфифильные крохелины элюировали 75% метанолом.Экстракты сушили (SpeedVac) и восстанавливали в 2 мл смеси 1: 1 метанол / вода. Экстракты дополнительно очищали с помощью ВЭЖХ с градиентом водного ацетонитрила с добавлением 0,1% муравьиной кислоты и уксусной кислоты. Элюирование амфибактинов контролировали при 220 нм. Объединенные фракции анализировали с помощью HPLC-MS и HPLC-UV / vis перед тем, как они были высушены (SpeedVac, ThermoFisher) и восстановлены 2% d ₄ -метанолом для 1H-ЯМР-спектроскопической количественной оценки с использованием внешнего стандарта (метод PULCON).

Концентрация растворенного Fe

Концентрации железа ( ⁵⁶ Fe) в супернатантах измеряли масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой (Thermo iCAP-Q в режиме KED) после подкисления (10% HNO ₃ ) и разбавления (1: 5). Предел обнаружения железа ( ⁵⁶ Fe) составлял примерно 0,10 мкМ.

Секвенирование генома

AC-B3 выделяли с использованием набора для экстракции ДНК Qiagen Genomic Tip.Образцы библиотеки вставок размером 10 т.п.н. были приготовлены в центре молекулярной биологии в библиотеке Принстонского университета до секвенирования генома в центре высокопроизводительного секвенирования UC Irvine Genomics. Считывания секвенирования, сгенерированные из 5 одномолекулярных клеток в реальном времени (SMRT) системы секвенатора Pacific Biosciences RS2 (Pacific Biosciences, Менло-Парк, Калифорния), дали более чем 20-кратное среднее покрытие генома. Последовательности чтения были собраны de novo с использованием непрерывных длинных чтений (CLR) в соответствии с рабочим процессом процесса иерархической сборки генома (HGAP) (PacBio DevNet; Pacific Biosciences), доступным в SMRT Analysis v2.0. Рабочий процесс PacBio с последующей ручной сборкой самого большого фрагмента дал черновой вариант генома AC-B3, состоящий из одной замкнутой кольцевой хромосомы (4 575 910 п.н.) и 3 линейных плазмид (pacX50fB3, 306 103 п.н .; pacX50dB3a, 74 783 п.н .; pacX50dB3b, 66 259 п.н.). Эти последовательности были аннотированы конвейером автоматической аннотации прокариотических геномов NCBI (Национальный центр биотехнологической информации). Последовательности генома были депонированы в качестве черновых проектов полногеномных дробовиков в GenBank под номерами доступа CP011835 – CP011838.Версии, описанные в этой статье, являются первыми.

Анализ генома

Предполагаемые гены сидерофоров были идентифицированы в последовательностях генома Azotobacter (см. Таблицу S3, ESI †) с использованием программного обеспечения для анализа генома вторичных метаболитов AntiSmash, ⁴⁹ , программного обеспечения для аннотации генов RAST, ⁵⁰ и целевого анализа гомологии BLAST. Гены сидерофоров сравнивали с генами штамма CA A. vinelandii (номер доступа в GenBank CP005094), ранее описанного в ссылке.14, 51, 52. Филогении были сконструированы с использованием выравнивателя MUSCLE ⁵³ и опций PHYML в программной среде Geneious ⁵⁴ (версия 11.0.4) и базе данных рРНК SILVA. ⁵⁵

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Вэй Ванга и Ланса Парсонса из Института интегративной геномики Льюиса-Сиглера (Принстонский университет) за помощь в секвенировании генома, Мохаммеда Сейедсаямдоста за полезные обсуждения (Принстонский университет), Национальный научный фонд (грант EAR-1631814 для X.Z. and OCE 1315200 F. M. M. M.) и Премию за инновационные исследования Принстонского института окружающей среды (O. B.) за поддержку этой работы. О. Б. была поддержана проектом 201367 Национального института продовольствия и сельского хозяйства на этапах анализа и написания этой работы.

Примечания и ссылки

J. P.

Thompson

V. B. D.

Skerman

Azotobacteraceae: Таксономия и экология аэробных азотфиксирующих бактерий

Academic Press

, Великобритания

RL

Robson

R.

Jones

RM

Robson

A.

Schwartz

TH

Richardson

Azocotobacter ATCC 4412)

PLoS One

2015

10

e0127997

Дж. Х.

Бекинг

Прокариоты

M.

Dworkin

S.

Falkow

E.

Rosenberg

KH

Schleifer

E.

Stackebrandt

Springer

, США, Нью-Йорк,

, США.

2006 г.

6

759

783

С.А.

Вани

С.

Чанд

М.А.

Вани

М.

Рамзан

К. Р.

Хаким

Почвоведение: перспективы сельского хозяйства и окружающей среды

K. R.

Hakeem

J.

Akhtar

M.

Sabir

Springer International Publishing

Cham

2016

333

34

К. В. Б. Р.

Тилак

К. К.

Пал

Р.

Dey

Микробы для устойчивого сельского хозяйства

I.K. Международный издательский дом

Нью-Дели, Индия

2010

MV

Мартинес Толедо

J.

Gonzalez-Lopez

T.

de la Rubia

J.

Moreno

A.

Ramos-Cormenzana инокуляция Azotobacter chroococcum на нитрогеназную активность корней Zea mays, выращенных на сельскохозяйственных почвах в асептических и нестерильных условиях

Biol.Fertil. Почвы

1988

6

170

173

M. E.

Brown

S. K.

Burlingham

Производство веществ для выращивания растений с помощью Azotobacter chroococcum

J. Gen. Microbiol.

1968

53

135

144

M.

Kelly

Некоторые свойства очищенной нитрогеназы Azotobacter chroococcum

Biochim.Биофиз. Acta

1969

171

9

22

RL

Robson

RR

Eady

TH

Richardson

RW

Miller

M.

Hawkins

JR Post

chroococcum — фермент ванадий

Nature

1986

322

388

390

RL

Robson

PR

Woodley

RN

Pau

RR

Eady

Структурные гены ванадиевой нитрогеназы из Azotocum20003000

8

1217

1224

C.C.

Walker

M. G.

Yates

Водородный цикл в азотфиксирующей Azotobacter chroococcum

Biochimie

1978

60

225.

L.

Du

K.

Tibelius

E.

Souza

R.

Garg

M.

Yates

Последовательности, организация и анализ гены из кластера генов гидрогеназы Azotobacter chroococcum

J. Mol. Биол.

1994

243

549

557

C.

Ford

N.

Garg

R.

Garg

K.

Tibelius

M.

Yates

D.

Arp

L.

Идентификация

Mol. Microbiol.

1990

4

999

1008

O.

Baars

X.

Zhang

F. M. M.

Morel

M.

Seyedsayamdost

Сидерофор метаболом и 9000 Appl. Environ. Microbiol.

2016

82

27

39

D. L.

McRose

O.

Baars

F. M. M.

Morel

A.M. L.

Kraepiel

Производство сидерофоров в Azotobacter vinelandii в ответ на ограничение Fe, Mo и V

Environ. Microbiol.

2017

19

3595

3605

O.

Baars

X.

Zhang

MI

Gibson

AT

Stone

FMM

Morel

ins MR

беспрецедентный хелатирующий железо фрагмент из азотфиксирующей бактерии Azotobacter chroococcum

Angew.Chem.

2018

130

545

550

S. A.

Amin

D. H.

Зеленый

F. C.

Küpper

C.J.

Carrano

Вибриоферрин, необычный морской сидерофор 2000 Влияние, связывание железа и фото. Chem.

2009

48

11451

11458

E. F.

Wawrousek

J. V.

McArdle

Спектроэлектрохимия ферриоксамина B, феррихрома и феррихрома A

J. Inorg. Biochem.

1982

17

169

183

I.

Спасоевич

SK

Армстронг

TJ

Брикман

AL

Крамблисс

Электрохимическое поведение комплексов Fe (III) гидрокарбоната и сульфоэфосфата алкилоксина 9000 алкалигидеринфосфата 3000 ,

Неорг.Chem.

1999

38

449

454

S.

Suneja

N.

Narula

R. C.

Anand

K.

Lakshminarayana

Взаимосвязь Azotobacter chroococcum, фиксация азота 9000 с азотом сидерофором 9000.

1996

41

154

158

W. J.

Стр.

Железозависимое производство гидроксамата натрий-зависимым Azotobacter chroococcum

Прил.Environ. Microbiol.

1987

53

1418

1424

FA

Fekete

RA

Lanzi

JB

Beaulieu

DC

Longcope

AW

Sulya

Выделение и предварительная характеристика гидроксамовых кислот, образованных азотфиксирующей Azotobacter chroococcum B-8

Appl.Environ. Microbiol.

1989

55

298

305

A.

Корниш

W.

Страница

Производство триацетехолат сидерофоров протохелина с помощью Azotobacter vinelandii

Biometals

1995

8 332

W. A. ​​

Bulen

J. R.

LeComte

Выделение и свойства желто-зеленого флуоресцентного пептида из среды Azotobacter

Biochem.Биофиз. Res. Commun.

1962

9

523

528

W. J.

Page

M. v.

Tigerstrom

Аминохелин, катехоламиновый сидерофор, производимый Azotobacter vinelandii

J. Gen. Microbiol.

1988

134

453

460

JL

Corbin

WA

Bulen

Выделение и идентификация 2,3-дигидроксибензойной кислоты и N2, N6-ди (2,3-дигидроксибензоил) -L-лизина, образованного железодефицитными Azotobacter vinelandii

Биохимия

1969

8

757

762

W.

Page

SK

Collinson

P.

Demange

A.

Dell

M.

Abdallah

с идентичными структурами

Биол. Встретились.

1991

4

217

222

A. S.

Корниш

W.J.

Page

Роль молибдата и других переходных металлов в накоплении протохелина Azotobacter vinelandii

Прил. Environ. Microbiol.

2000

66

1580

1586

J. M.

Harrington

J. R.

Bargar

A. A.

Jarzecki

J. G.

Roberts

L.A.

Sombers

W.

Duckworth

Комплексообразование следов металлов с помощью трискатехолатного сидерофора протохелина: структура и стабильность

Biometals

2012

25

393

412

A. L.

Crumbliss

J. M.

Harrington

Секвестрация железа малыми молекулами: термодинамические и кинетические исследования природных сидерофоров и синтетических модельных соединений

Adv.Неорг. Chem.

2009

61

179

250

O.

Baars

F. M. M.

Morel

D. H.

Perlman

ChelomEx: обнаружение изотопов хелатов металлов в сложных средах с использованием ЖХ-МС высокого разрешения

Anal. Chem.

2014

86

11298

11305

К.

Блин

H.U.

Kim

M.H.

Medema

T.

Weber

Недавняя разработка анти-SMASH и других вычислительных подходов к поиску кластеров генов биосинтеза вторичных метаболитов

Краткое содержание. Биоинформ.

2017

bbx146

G. L.

Challis

Широко распространенный бактериальный путь биосинтеза сидерофоров, не зависящий от нерибосомных пептидных синтетаз

ChemBioChem

2005

6

601 6000113.

AJ

фургон Tonder

S.

Mistry

JE

Bray

DMC

Hill

AJ

Cody

Farman

KL

A.

von Gottberg

SD

Bentley

J.

Parkhill

KA

Jolley

MCJ

Maiden

A.B.

Brueggemann

Определение предполагаемого основного генома бактериальных популяций с использованием байесовской модели принятия решений

PLoS Comput. Биол.

2014

10

e1003788

SK

Thode

E.

Rojek

M.

Kozlowski

R.

Ahmad

P.

Haugen

PLoS One

2018

13

e01

JS

Martinez

JN

Carter-Franklin

EL

Mann

JD

Martin

MG

Haygood

A.

A.

сродство набора амфифильных сидерофоров, продуцируемых морской бактерией

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2003

100

3754

3759

J.

Vraspir

P.

Holt

A.

Butler

Идентификация новых членов в наборах амфифильных морских сидерофоров

Biometals

000

000

85

92

M. P.

Kem

H. K.

Zane

S. D.

Springer

J. M.

Gauglitz

A.

Батлер

Производство амфифильных сидерофоров ассоциированными с нефтью микробами

Metallomics

2014

6

1150

1155

R. C.

MacLean

A.

San Millan

Эволюция микроорганизмов: к разрешению парадокса плазмид

Curr. Биол.

2015

25

R764

R767

U.

Антоненка

C.

Nölting

J.

Heesemann

A.

Rakin

Горизонтальный перенос высокопатогенного островка Yersinia конъюгированным шаттлом-мишенью 9000RP4 attBm.

Мол. Microbiol.

2005

57

727

734

C. R.

Osorio

A. J.

Rivas

M.

Balado

JC

Fuentes-Monteverde

J.

Rodríguez

C.

Jiménez

ML

Lemos

MK

трансмиссивный остров патогенности обеспечивает биосинтез рыбактина у патогена рыб Photobacterium damselae subsp. piscicida

Appl. Environ. Microbiol.

2015

81

5867

H.

Naka

M.

Liu

LA

Actis

JH

Crosa

Плазмиды и хромосомы: кодируемые плазмидой и хромосомами системы сидерофоров и биоптатов, транспортирующие биогибактиносы, обнаруженные в морских вибрационных системах evolution

Biometals

2013

26

537

547

M. R.

Seyedsayamdost

S.

Cleto

G.

Carr

H.

Vlamakis

M.

João Vieira

R.

Kolter

J.

Clardy

Смешение кластеров серофореза и серофореза: смешивание и согласование структуры биосинтеза и серофореза. от Serratia sp. V4

J. Am. Chem. Soc.

2012

134

13550

13553

J.

Gauglitz

A.

Батлер

Аминокислотная изменчивость в составе пептидов набора амфифильных пептидных сидерофоров из открытого океана Vibrio видов

JBIC, J. Biol. Неорг. Chem.

2013

18

489

497

A. E.

Martell

R. M.

Smith

R.J.

Motekaitis

NIST Критически выбранные константы устойчивости металлических комплексов База данных

База данных 46 Версия 7.0 для Windows

Гейтерсбург, Мэриленд, США

2003

Z.

Dumas

A.

Ross-Gillespie

R.

Kümmerli

Переключение между явно избыточными механизмами поглощения железа приносит пользу бактериям в изменчивой среде

Proc. R. Soc. В

2013

280

20131055

H.

Bruns

M.

Crüsemann

A.-C.

Letzel

M.

Alanjary

JO

McInerney

PR

Jensen

S.

Schulz

mer BS

Moore

Функциональная замена бактериальных сидерофорных путей

ISME J.

2017

12

320

К. К.

Хорнер

Д.

Burk

G. E.

Allison

M. S.

Sherman

Фиксация азота Azotobacter под влиянием молибдена и ванадия

J. Agric. Res.

1942

65

173

193

T.

Weber

K.

Blin

S.

Duddela

D.

Krug

H.U.

Kim

R.

Bruccoleri

SY

Lee

MA

Fischbach

R.

Müller

W.

Wohlleben

R.

MH

Medema

antiSMASH 3.0 — исчерпывающий ресурс для анализа генома кластеров биосинтетических генов

Nucleic Acids Res.

2015

43

W237

W243

R.

Overbeek

R.

Olson

GD

Pusch

GJ

Olsen

JJ

Davis

Dis

S.

Gerdes

B.

Parrello

M.

Shukla

V.

Vonstein

AR

Wattam

F.

Xia

R.

Stevens

SEED и быстрое аннотирование микробных геномов с использованием Subsystems Technology (RAST)

Nucleic Acids Res.

2014

42

D206

D214

AE

Tindale

M.

Mehrotra

D.

Ottem

WJ

Page

Двойное регулирование катехолат-сидерофоров и биосинтеза железа, биосинтеза

000 и окислительного стресса винто-биосинтезом

2000

146

1617

1626

F.

Yoneyama

M.

Yamamoto

W.

Hashimoto

K.

Murata

произведено в ответ на молибден

J. App. Microbiol.

2011

111

932

938

R.C.

Edgar

MUSCLE: множественное выравнивание последовательностей с высокой точностью и высокой пропускной способностью

Nucleic Acids Res.

2004

32

1792

1797

M.

Kearse

R.

Moir

A.

Wilson

S.

Stones-Havas

M.

Cheung

Stur

S.

Бакстон

A.

Cooper

S.

Markowitz

C.

Duran

T.

Thierer

B.

Ashton

P.

Meintjes

A.

Drummond

Geneious Basic: интегрированная и расширяемая настольная программная платформа для организации и анализа данных последовательностей

Биоинформатика

2012

28

1647

1649

E.

Pruesse

C.

Quast

K.

Knittel

BM

Fuchs

W.

Ludwig

J.

Peplies

FO

Glockner

SILVA, проверенный онлайн-ресурс для проверки качества и качества Ribosal данные совместимы с ARB

Nucleic Acids Res.

2007

35

7188

7196

Заметки автора

© Королевское химическое общество, 2019

Эта статья публикуется и распространяется на условиях Oxford University Press, Standard Journals Publication Model (https: // Academic.oup.com/journals/pages/open_access/funder_policies/chorus/standard_publication_model)

Видеодомофон и видеодомофон для iOS, Android, iPhone, iPad, смартфонов и планшетов

Версия iOS и Android, Аппаратное обеспечение

При разработке приложений мы всегда должны действовать в соответствии со спецификациями и руководящими принципами, предоставленными Apple и Google, которые предполагают, среди прочего, что приложения и обновления приложений для App Store и Google Play Store всегда должны разрабатываться с использованием последних версий iOS и Android.Это, конечно, также означает, что новые приложения зарезервированы для текущих операционных систем и оборудования смартфонов. Поскольку наши продукты также связаны с безопасностью, мы рекомендуем всегда использовать последний смартфон с самой последней обновленной версией iOS или Android.

Вы можете найти текущие минимальные требования для приложения в Apple App- или Google PlayStore в зависимости от вашей операционной системы.

Интеграция с Apple HomeKit

Мы все еще ведем активные переговоры с Apple относительно интеграции «HomeKit».Мы хотели бы предложить держать вас в курсе по этой теме с помощью нашего информационного бюллетеня.

Защита от несанкционированного доступа электрического открывателя двери

Как правило, любой электрический механизм открывания двери, подключенный прямым проводом токоведущего провода к домофону, может быть взломан. Это относится ко всем домофонам (по физическим причинам), а также почти исключительно к тому, как электрические открыватели дверей устанавливаются во всем мире.

Для большей безопасности мы рекомендуем вам защитить электрический дверной открыватель тамперным контактом, который имеет дистанционное реле безопасности.В качестве решения этой темы в нашем магазине мы действительно предлагаем собственный дверной контроллер A1081.

В качестве альтернативы вы также можете зашифровать сигнал открывания двери через IP и отправить его на устройство открывания двери через вашу систему домашней автоматизации. Мы предлагаем комплексный API для интеграции в сторонние системы: http://www.doorbird.com/api

Функция RFID (серия D10x / D11x / D20x / D21x)

Серия D10x / D20x:

The Серия D10x / D20x имеет встроенный приемопередатчик 433 МГц, который изначально планировался для управления дополнительными датчиками и пультами дистанционного управления (например.грамм. гаражные ворота). К сожалению, в этом плане не только мало спроса, но и отсутствие сторонних провайдеров, использующих соответствующие модули. Таким образом, модуль 433 МГц остается неактивным.

Серия D21x:

Серия D21x оснащена встроенным считывателем RFID 125 кГц для контроля доступа (система активного считывания пассивных тегов (ARPT)), как указано в ISO / IEC 18000-2: 2009 Часть 2, которая делает они совместимы с другими брелоками и системами ввода карт сторонних производителей.

Можно зарегистрировать до 200 брелоков.

Серия D11x:

Серия D11x не имеет встроенного модуля RFID.

Push-сообщения не отображаются или только задерживаются

Как только посетитель звонит на устройство, сообщение отправляется непосредственно на push-сервер Apple / Google. Обычно операционная система мобильного конечного устройства (iOS, Android) управляет приемом и отображением push-уведомлений. Приложение DoorBird работает так же, как и любое другое приложение, и обычно требуется 2-3 секунды, пока push-уведомление не появится на вашем мобильном устройстве.

Наиболее частыми примерами являются (отсортированные по частоте появления):

Сетевой компонент в вашей сети переходит в спящий режим и снова выходит из спящего режима только в результате активности вашего мобильного устройства. Решение: обновите прошивку компонентов Wi-Fi (например, маршрутизатора или ретранслятора) в вашей сети

• Операционная система ограничивает фоновую активность приложения DoorBird и, таким образом, предотвращает своевременную доставку push-сообщений. В Android соответствующие настройки обычно можно найти в разделе «Настройки» → «Приложения» → «DoorBird» → «Аккумулятор».
• Интернет-соединение мобильного устройства нестабильно (Wi-Fi или мобильная передача данных). Решение: Улучшите возможность подключения мобильного устройства. Скорость интернета, заказанная у оператора мобильной связи, не является достаточной информацией.
• Подключение устройства к Интернету нестабильно (Wi-Fi или Ethernet). Решение: Улучшите возможность подключения устройства. Информация о скорости интернета, заказанная у интернет-провайдера, недостаточна.
• Мобильное устройство находится в спящем режиме или режиме «Не беспокоить». Решение: Наше приложение DoorBird не отменяет системные настройки вашего мобильного устройства.Отключите этот режим, чтобы получать push-уведомления.
• В операционной системе мобильного телефона активированы параметры экономии заряда аккумулятора, которые автоматически завершают приложения и процессы, работающие в фоновом режиме. Решение: Добавьте приложение DoorBird в список исключений, чтобы на него не влияла функция энергосбережения.
• На мобильном устройстве установлены приложения, которые подпадают под категорию «экономия заряда батареи», «очиститель кеша», «оптимизатор системы». Приложения в этой категории завершают процессы, выполняющиеся в фоновом режиме. Решение: Добавьте приложение DoorBird в список исключений, чтобы оно не мешало работе приложения DoorBird.
• Push-уведомления о событиях не активируются в настройках приложения DoorBird. Решение: Откройте приложение DoorBird → Настройки → щелкните добавленное устройство (например, aabbcc0001) → Push-уведомления → Дверной звонок → Активировать

IP-видеодомофон DoorBird не может быть добавлен для просмотра в реальном времени — «Ошибка добавления».

Мы отправляем все дверные IP-видеодомофоны DoorBird с административным доступом (например,грамм. abcdef0000) и одного предварительно настроенного пользователя приложения (например, abcdef0001), чтобы иметь возможность быстро установить устройство и протестировать его.

Для облегчения ввода данных в документе «Цифровой паспорт» доступны QR-коды, которые действительны до тех пор, пока не будут изменены данные пользователя в администрировании приложения DoorBird.

Если дверная панель видеодомофона DoorBird IP находится в режиме онлайн в соответствии с онлайн-проверкой (https://www.doorbird.com/checkonline), но приложение DoorBird отображает сообщение об ошибке при добавлении пользователя приложения для просмотра в реальном времени, В 99% случаев пользователь предварительно настроенного приложения (например,грамм. abcdef0001) был изменен или даже удален.

Это можно проверить в приложении DoorBird:

Настройки → Администрирование → Вход → Пользователи → Настройки

a) Если пользователь приложения (например, abcdef0001) больше не существует, создайте нового пользователя, запишите имя пользователя и пароль, а затем добавьте их, введя их вручную.

b) Если пользователь приложения (например, abcdef0001) существует, но пароль отличается от цифрового паспорта, запишите новый пароль и затем добавьте его, введя его вручную.

Подсказка: вы можете использовать функцию «Поделиться данными пользователя», чтобы сгенерировать новый QR-код для пользователя. Вы можете открыть почтовый клиент для пересылки информации или напрямую создать PDF-файл, который можно сохранить на смартфоне или поделиться через другие приложения.

Если невозможно войти в систему администрирования приложения DoorBird, хотя устройство находится в режиме «онлайн», мы рекомендуем выполнить сброс до заводских настроек по умолчанию, как указано в следующей статье:

https: // www .doorbird.com/faq#id-107

Общая информация о приложении

Убедитесь, что вы используете последнюю версию приложения Door Bird. Часто запросы относятся к устаревшим версиям приложений. Также не забудьте перезагрузить смартфон / планшет, поскольку некоторые проблемы связаны с операционной системой.

iOS: https://apps.apple.com/us/app/doorbird/id898756315

Android: https://play.google.com/store/apps/details?id=com.doorbird .doorbird

Детектор движения

Для устройств со встроенным датчиком движения вы можете активировать его в администрировании приложения DoorBird (приложение DoorBird → Настройки → Администрирование → Вход → Датчик движения → Настройки).

Push-уведомления

Если датчик движения включен, и вы хотите получать push-уведомления о событиях движения, вам необходимо включить их отдельно в настройках мобильного устройства (приложение DoorBird → настройки → нажмите на добавленное пользователь, e.грамм. abcdef0001 → push-уведомления → движение).

Облачная запись

Облачная запись для событий движения должна быть включена отдельно (приложение DoorBird → Настройки → Администрирование → Вход → Облачная запись → Датчик движения → Настройки).

У пользователя должно быть активное разрешение на просмотр событий движения (приложение DoorBird → Настройки → Администрирование → Вход → Пользователи → Настройки → щелкните нужного пользователя, например, abcdef0001 → разрешения → движение).

Расписание

Push-уведомления и облачная запись требуют одного и того же активированного расписания (приложение DoorBird → Настройки → Администрирование → Вход → Датчик движения → Настройки → Расписание действий → Push-уведомление).

Devolo / HomePlug / Powerline

По нашему опыту, адаптеры Devolo / HomePlug / Powerline, к сожалению, не подходят для домофонов, поскольку они не передают все данные правильно. Нам также известен аналогичный опыт работы с конкурирующими продуктами. К сожалению, мы никак не влияем на эту технологию.

Облачная запись

Все дверные станции видеодомофона DoorBird IP имеют встроенную бесплатную историю изображений.

Дополнительную информацию о нашей функции «Облачная запись» можно найти на следующей странице:

https: // www.doorbird.com/cloud-recording

Запись видео / Сторонние системы / Интеграция

Мы предлагаем комплексный открытый API для любых сторонних интеграций (например, NAS, NVR, VMS, Home Automation, Smart Home и т. д.). Дополнительную информацию можно найти в Интернете: https://www.doorbird.com/api

Кроме того, мы уже предлагаем инструкции по многим интересным интеграциям на наших страницах подключения DoorBird: https://www.doorbird.com/connect

Размеры конкретного устройства

Вы можете найти размеры и дополнительную информацию в технических паспортах под каждым продуктом в нашем интернет-магазине: https: // www.doorbird.com/buy

Не стесняйтесь обращаться, если у вас есть какие-либо вопросы относительно наших продуктов: https://www.doorbird.com/contact

Требуемая скорость Интернета

Для DoorBird требуется высокая скорость Интернет (стационарный): DSL, кабель или оптоволокно, с DHCP. Скорость загрузки в Интернет минимум 0,5 Мбит / с или выше. Чем быстрее Интернет, тем лучше качество изображения и звука. Не подключайте DoorBird к маршрутизатору 3G / 4G / LTE (стабильность, задержка, потеря пакетов TCP / UDP).

Всепогодный дизайн

DoorBird был разработан для использования вне помещений в суровых условиях окружающей среды. Таким образом, он был сертифицирован в соответствии с промышленным стандартом IP65 и аккредитован на соответствие требованиям класса защиты A1 от дождя и снега (который, например, является стандартом в Северной Европе, Северной Америке и Канаде).

Последовательность уведомления мобильных устройств

Сигнал вызова — это очень критичный по времени сигнал в практическом использовании.Следовательно, невозможно определить последовательность для смартфонов / планшетов, которая обрабатывается один за другим, когда посетитель звонит в дверной звонок.

Все пользователи одновременно получают уведомления на своих смартфонах с помощью push-уведомлений и могут видеть посетителя в режиме реального времени.

Если пользователь получит сигнал только через 30-60 секунд, т. Е. Если нет ответа от ранее уведомленного пользователя, посещение уже давно прошло.

Обычная кнопка открывания двери

Наши модели поддерживают использование обычной кнопки открывания двери внутри дома для открытия входной двери, гаража и т. Д.без смартфона или планшета. Убедитесь, что кнопка обесточена, например https://secure.effeff.de/index.php?key=produktkatalog&ID=100318&c=effeff&treeID=157526&lang=en

Обязательно следуйте инструкциям и схеме подключения в руководстве.

Монтажная высота / объектив

Во всех моделях нашей IP-видеодомофона используется полусферический сверхширокоугольный объектив. Это означает, что небольшой монтажной высоты достаточно для отображения человека перед устройством на минимальном расстоянии (~ 50 см / 20 дюймов).

Невозможно повернуть модуль камеры или механически отрегулировать объектив на любой модели, поэтому горизонтальная установка IP-видеодомофона невозможна.

Объектив камеры должен быть установлен на высоте не менее 145 см / 57 дюймов.

Серия D11: Благодаря своей компактной конструкции эта серия идеально подходит для мест, где нельзя установить другие модели. Для этого в нашем интернет-магазине мы предлагаем дополнительные монтажные кронштейны, которые подходят для сложных условий монтажа.

Перед установкой всегда проверяйте оптимальную высоту установки для вашего местоположения.

Облачная служба

Наши продукты представляют собой облачные решения (см. Также NEST, Dropbox и т. Д.). Из соображений надежности и безопасности переадресация портов через Интернет не выполняется (с использованием NAT или DynDNS). Наши продукты устанавливают зашифрованное соединение через туннель VPN с нашим облачным сервером (расположенном в центре обработки данных с высокой степенью защиты в Германии).

В наших продуктах используется та же технология защищенной связи, которую финансовые учреждения используют для онлайн-банкинга (SSL).Удаленный доступ через наш облачный сервер — бесплатно.

Технически невозможно использовать наши продукты автономно без доступа в Интернет или без доступа к нашим облачным серверам, поскольку в противном случае ключевые функции, такие как, например, push-уведомления (специальные сертификаты безопасности сервера, требуемые Apple и Google), удаленный доступ, периодический бесплатные обновления программного обеспечения и т. д. будут недоступны.

Все решение протестировано и одобрено государственным ведомством Германии, ответственным за конфиденциальность и безопасность данных.

Если вы хотите работать без облачного сервера, вы можете использовать автаркическую IP-систему, например, Siedle или Gira, которые, разумеется, не обладают такой же функциональностью. Как поставщик интеллектуальных и удобных решений для умного дома, мы не предлагаем продукты без подключения к нашему Cloud-серверу. Невозможно использовать сторонние облачные сервисы, например из Google Drive, ownCloud, Dropbox, Microsoft Azure, Amazon S3 (в целях безопасности!).

Приложение для Windows / macOS или доступ через браузер

Наши дверные IP-видеодомофоны поддерживают безопасное и бесперебойное использование с популярными смартфонами и планшетами (iOS, Android) или нашей внутренней IP-видеодомофоной A1101.

На других платформах мы дополнительно предлагаем возможность для современных веб-браузеров настраивать устройство с помощью инструмента веб-администрирования, а также просматривать изображение в реальном времени с помощью виджета HTML5.

Инструмент веб-администрирования: https://webadmin.doorbird.com

HTML5-Widget: https://www.doorbird.com/widget

Фиксированный внутренний блок видео — A1101

Как фиксированный внутренний блок видео мы Рекомендуем использовать нашу компактную внутреннюю IP-видеодомофон A1101 вместе со всеми дверными IP-видеодомофонами DoorBird.Абонентская IP-видеопанель A1101 оснащена 4-дюймовым сенсорным экраном True Color с устойчивым к царапинам закаленным стеклом Gorilla® и отличным качеством звука.

Кроме того, мы предлагаем настольную подставку A8003, которая предназначена для использования внутренней IP-видеостанции A1101 на столах и буфетах.

Оба продукта вы можете найти в нашем интернет-магазине: https://www.doorbird.com/buy

Количество оконечных устройств

Видеодомофон DoorBird IP позволяет использовать до восьми мобильных устройств (iOS, Android) или внутренних станций. на кнопку вызова для параллельного доступа к просмотру в реальном времени.

Когда кто-то звонит в DoorBird, push-уведомление отправляется на все мобильные устройства, которые зарегистрированы для кнопки вызова и имеют активированные push-сообщения для приложения DoorBird.

Защита от кражи

Наши дверные видеодомофоны DoorBird IP защищены от кражи специальными винтами, как и любые другие высококачественные домофоны.

На данный момент известно только два случая кражи дверной IP-видеодомофона DoorBird. В случае кражи устройство может быть полностью заблокировано.

В случае кражи вы можете прислать нам копию официального полицейского протокола. Мы найдем для вас решение.

Дополнительные камеры / Интеграция сторонних камер в приложение Doorbird

BirdGuard B101 — это дополнительная камера, которой можно управлять в нашем приложении DoorBird.

Интеграция сторонних камер невозможна в сочетании с приложением DoorBird.

Вы можете легко интегрировать BirdGuard B101, а также наши дверные IP-видеодомофоны DoorBird в системы сторонних производителей.

Мы предлагаем дополнительную информацию по интеграции со сторонними системами: http://www.doorbird.com/faq#id-34

Монтаж на стене с термозащитой

При установке используется специальный разъем. компоненты на стене с термозащитой, например этот продукт: http://www.conrad.de/ce/de/product/484198/

Пожалуйста, уточните это у производителя вашей изоляции, чтобы точно узнать, какую именно вилку рекомендуется использовать в данном случае.Вы можете найти требуемый диаметр винтов, указанный в руководстве по монтажу DoorBird.

Подключение электронного устройства открывания двери / гаража / ворот или защелки

Наши дверные IP-видеодомофоны позволяют подключать стандартные электрические устройства открывания дверей, ворот или гаражей (два провода). Можно подключить все открыватели дверей, которые можно использовать, в диапазоне до 24 В (AC / DC) и 1 А. Более подробную информацию и схематическую диаграмму можно найти в руководстве для соответствующей модели.

IP-видеодомофоны не обеспечивают питание открывателя. Должен быть предусмотрен отдельный источник питания. За подходящим источником питания и дополнительной информацией обращайтесь к производителю дверного открывания.

Пример дверного замка: http://secure.effeff.de/index.php?key=produktkatalog&lang=en&action=suche&pk_searchbox=17E———D11

Статический IP-адрес / DHCP

We не имеют встроенного способа вручную настроить детали статического IP-адреса в нашей прошивке.Если вам необходимо настроить одно из наших сетевых устройств на работу со статическим IP-адресом, вам следует удобно настроить это на своем DHCP-сервере / маршрутизаторе для определенного MAC-адреса нашего сетевого устройства. Настройка статических IP-адресов в устройстве без использования DHCP на практике приводит к хорошо известным проблемам, поэтому в современной сети это никогда не рекомендуется.

SIP

Все дверные IP-видеодомофоны DoorBird имеют встроенный модуль SIP для интеграции с различными SIP-телефонами и системами домашней автоматизации для удовлетворения передовых потребностей в аудио- и видеосвязи.Таким образом, DoorBird предоставляет возможность выполнять интеграцию SIP через интерфейс SIP, доступ к которому можно получить через приложение (приложение DoorBird -> Настройки -> Администрирование -> Вход -> Настройки SIP). Поскольку протокол SIP не стандартизирован, любую интеграцию необходимо настраивать индивидуально. Это возможно только при значительных усилиях, и DoorBird не предоставляет никакой поддержки для отдельных интеграций SIP. DoorBird постоянно работает над интеграцией протокола SIP.

Все совместимые SIP-устройства и руководства по установке можно найти здесь: www.doorbird.com/sip

Проблема с подключением к мобильной телефонной сети?

В некоторых регионах операторы сети мобильной связи блокируют доступ к определенным службам или по стандартным портам (например, HTTP [80], HTTPS [433]), например из-за использования пассивного прокси-сервера или из-за ошибочной маршрутизации (обычно временная проблема). Этот случай очень редок, но его нельзя обойти, не зная, как оператор сотовой сети блокирует какие данные. Простым обходным решением для проверки является временное использование службы VPN, например.грамм. www.vyprvpn.com (бесплатно для короткого теста).

Если подключение возможно с помощью службы VPN, свяжитесь со своим оператором мобильной сети и отправьте эту информацию: https://www.doorbird.com/downloads/misc/ports_en.pdf

Wi-Fi / Wi- Проблемы с сетью Fi / кабель Ethernet

D10x / D11x / D20x / D30x / A106x / A108x / A110x:

Для устройств со встроенным модулем WLAN мы явно включили в дизайн продукта пункт «Диапазон WLAN». Поэтому наши устройства обеспечивают значительно лучшие результаты, чем многие соответствующие продукты конкурентов.

Если у вас возникли проблемы с Wi-Fi или вам нужна дополнительная информация о том, как его настроить, вы можете найти помощь на следующей странице: https://www.doorbird.com/wifi

К сожалению и независимо от нашей помощи , всегда есть среды, в которых Wi-Fi не работает должным образом. Мы не можем на это повлиять, так как мы уже используем максимальное излучение антенны, разрешенное в ЕС, Канаде и США.

Как правило, из соображений стабильности (доступности, надежности) и возможных задержек для push-сообщений мы обычно рекомендуем подключать устройства через сетевой кабель.

D21x:

Эта серия не имеет встроенного модуля Wi-Fi и работает только через сетевой кабель.

Все модели:

Если в месте установки доступны только два провода (без сетевого кабеля), мы предлагаем решение в нашем магазине с 2-проводным преобразователем Ethernet PoE A1071.

Вы можете найти более подробную информацию об этом в следующей статье: http://www.doorbird.com/faq#id-118

Многодомная видеодомофон

Приложение DoorBird поддерживает до 10 видеодомофонов DoorBird и дополнительный BirdGuard камеры.

Вы можете переключаться вперед и назад между видеодомофонами и дополнительными камерами в приложении, нажав кончиком пальца.

Восстановление заводских настроек по умолчанию / Утерян цифровой паспорт / Утеряны учетные данные

Для следующих моделей можно восстановить заводские настройки:

D10x / D11x / D20x / D21x / D30x / A1101 / A1061W / A1081 / B101