Вход в указанные города откроет новые возможности для покупок и точки сохранения, но не более того. Популярная жалоба на Final Fantasy XIII от некоторых поклонников старых игр заключалась в том, что она не предоставила игрокам новые захватывающие города, которые они могли бы открыть и упомянуть в ветках интернет-форумов о лучших городах для ролевых игр всех времен; Type-0 не может успокоить эту толпу. Есть несколько городов, усеивающих карту мира, но, хотя игроки могут войти, они будут встречены только разочарованием из-за небольшого размера, обычного отсутствия большего количества магазинов, чем один, и сходства в стиле Wal-Mart.Некоторые из них, которые противоречат визуальной тенденции, наконец, появляются ближе к концу, но даже они в конечном итоге выглядят слишком похожими друг на друга и все еще кажутся микроскопическими.

Несколько раз обязательная мини-игра помещает игроков на карту мира и требует от них захвата определенного целевого города, почти имитируя стратегическую игру в реальном времени, за исключением стратегии. Хотя это неплохая идея для побочной игры, эти разделы кажутся пристроенными, с очень небольшим количеством стратегических вариантов и без настройки. Если у меня будет что-то похожее на RTS, я хочу что-то, что позволит мне сформулировать план атаки и попытаться его реализовать, но это как-то скучно.Во время последней из этих последовательностей, в которой драконы и армии разбросаны по всей карте, отставание в перемещении ужасное. Я запрыгнул на чокобо, чтобы ускорить процесс, но это мало помогло, насколько мучительно медленно все шло. Некоторые люди не будут возражать против них, но я считаю эти разделы пустой тратой времени.

Даже несмотря на это, Final Fantasy Type-0 обладает высокой реиграбельностью. Первый раунд сам по себе представляет собой длинную игру, но помимо этого есть больше сюжетных последовательностей, больше миссий и множество других небольших дополнений, которые открываются во втором и третьем прохождении.В этом пакете определенно более 100 часов игр.

Конечно, визуальные эффекты и музыка FFT0 находятся на самом высоком уровне, доводя первый КПК Sony до предела своих возможностей. Вблизи есть некоторые неровности за пределами кинотеатров, но ясно, что на PSP можно сделать не так много. Частично с помощью Риеко Микошибы Такехару Ишимото возвращается на место композитора, и, как и в случае с Crisis Core , он выбивает саундтрек из парка.Это почти слишком хорошо. Если бы я был Джонни Деппом, а это было бы Однажды в Мексике о, я бы пристрелил композитора за то, что он сделал что-то настолько великое.

Хотя это может не удовлетворить всех поклонников биполярного FF , Final Fantasy Type-0 — это адская игра. У него есть ряд мелких проблем, но их более чем затмевает невероятное удовольствие от насыщенной действием боевой системы, хороших персонажей, саундтрека мирового уровня и фантастического сюжета. Даже не обязательно сама история настолько хороша, а персонажи, усиливающие ее, и финал, просто накладывающий идеальную печать на вещи.

–

Laowa Argus 35 мм f/0,95 FF

Laowa Argus 35 мм f/0.95 FF — это самый светосильный 35-мм и самый широкий объектив f/0,95 на рынке. Оптические характеристики максимальны за счет включения 1 элемента из стекла ED, 1 асферической линзы и 4 стеклянных материалов с высоким коэффициентом преломления. Необычайно малая глубина резкости и мечтательное боке, создаваемые диафрагмой f/0,95, идеально подходят для портретной съемки. В то же время его непревзойденная производительность в условиях низкой освещенности для получения четких и выдающихся изображений делает его незаменимым инструментом для каждого фотографа и видеооператора.Широкое поле зрения позволяет записать в изображение больше фонов, а благодаря диафрагме f/0,95 можно добиться малой глубины резкости.

The Малая глубина резкости и Creamy Bokeh , созданные F / 0,95, заставляет объект выделяться из толпы. Это козырь для портретов и других атмосферных снимков.

Превосходная резкость и контрастность при f/0,95

Объектив Laowa 35mm f/0,95 обеспечивает исключительную резкость даже при полностью открытой диафрагме. Объектив обеспечивает четкое и детализированное изображение на портретном расстоянии. Сверхширокоугольная диафрагма f/0,95 позволяет легко создавать захватывающие кадры.

Самый светосильный 35 мм и самый широкий f/0,95

На том же расстоянии 35-мм объектив передает больше деталей по сравнению с более плотным 50-мм объективом.Это дает хорошее ощущение размера фона и может показать, в какой области находится объект.

Объектив также дает фотографам больше гибкости при кадрировании. Вы можете получить объект примерно того же размера, что и 50 мм, подойдя ближе к объекту. Кроме того, он по-прежнему будет предлагать больше деталей фона при сохранении объекта примерно того же размера в кадре.

День и ночь, ACE для астрофотографии

Отличная производительность, когда вы ограничены во времени в темных местах или хотите получить безумную скорость, чтобы снимать звезды без следов.Или вы можете делать новые вещи, такие как съемка живого видео со скоростью 24 кадра в секунду млечного пути.

Дизайн для фото и видео

Механизм переключения, позволяющий пользователям выбирать кольцо диафрагмы с щелчком или без щелчка. Отлично подходит для видеосъемки без заметных изменений при изменении диафрагмы.

Внутренняя фокусировка не только предотвращает попадание пыли в объектив, но и позволяет без проблем использовать аксессуары (поляризаторы, бленды и т.д.).

Laowa Argus 35 мм f/0,95 FF с низкофокусным дыханием идеально подходит для повествовательных съемок. Это устраняет отвлечение внимания на изменение угла зрения при перемещении фокуса с одного объекта на другой. Наряду с точной фокусировкой, обеспечиваемой 300-градусной резьбой фокусировки, этот объектив идеально подходит для видеосъемки.

Лепесток диафрагмы 15 создает гладкие, круглые сферы светящегося света без резкого боке. Мечтательное боке придает изображениям характер, что идеально подходит для визуально привлекательных изображений.

«Мальме» — «Челси» 0:1, Лига чемпионов: реакция после матча, рейтинги

Обе команды начали игру энергично, хотя и несколько неорганизованно и разрозненно. В конце концов мы пришли к ожидаемой схеме, но хотя «Челси» снова завладел мячом и доминировал по количеству бросков, в отличие от двух недель назад, они не смогли пробить свои ворота в первом тайме.

Кай Хаверц был ближе всех, но его бросок под острым углом был хорошо заглушен. Вратарь «Мальмё» с трудом обращался с мячом на протяжении всей игры, оставив несколько пикантных подборов, но в данном случае он был идеален.Алонсо был близок к тому, чтобы нанести один упомянутый отскок в сетку, в то время как Лофтус-Чик пару раз промазал верхний угол, один раз из-за углового удара головой, а затем снова из-за подкручивания сверху штрафной площади.

«Мальмё» также был близок к ударному голу, но Чолак промахнулся всего на несколько дюймов из-за акробатического удара мячом сверху, незадолго до перерыва.

Примерно то же самое было и во втором тайме, пока Каллум Хадсон-Одои не решил, что с него достаточно, включая невостребованный мяч Мальмё, и не отдал его Зиешу на блюдечке незадолго до отсчета часа.Он не мог промахнуться и не промахнулся. Это почти решило игру.

Тиаго Силва был близок к тому, чтобы удвоить наше преимущество, но его точный удар на угловой был сбит с линии.

«Челси» создал еще несколько моментов в последние 15 минут, нанеся более 20 бросков за игру, но не смог увеличить наше преимущество. Хаверц был ближе всех, прежде чем Пулишич пропустил гол в сетку последним ударом в игре.

Неважно; Работа выполнена. Три балла.

Беззаботный.

• Три замены по сравнению с выходными, в том числе оба крайних защитника плюс Лофтус-Чик, заменивший Канте, который отдыхал
• Рад, что наконец-то вернулся Кристиан Пулишич. Он играл в финале 15+ вместе с Баркли, который больше играл в полузащите, чем Зиеш (то есть больше 3-5-2)
• Использованы только две замены, счет на протяжении всего матча
• Мальме не забивает по воротам. 12 сухих матчей в 16 играх Лиги чемпионов для Менди
• У «Челси» сейчас 9 очков из 12 в группе.Если «Ювентус» обыграет «Зенит» позже сегодня, мы практически (почти) в плей-офф.
• Далее: «Бернли» дома в субботу, затем международный перерыв
• КТБФФХ

РЕЙТИНГИ ИГРОКА:

Индуцированный диетой адаптивный термогенез требует передачи сигнала нейропептидом рецептора FF-2

Животные

Все исследования и процедуры по уходу за животными были одобрены Институтом Гарвана/St. Комитет по этике животных больницы Винсента и Комитет по уходу за животными и этике Университета Нового Южного Уэльса в соответствии с Австралийским сводом правил по уходу и использованию животных в научных целях.Мышей содержали в условиях контролируемой температуры (22°C для стандартной лабораторной температуры; 28°C для термонейтральности) и освещения (12-часовой световой цикл, свет включается в 07:00). Мыши имели свободный доступ к воде и питались либо обычной пищей (8% калорий за счет жира, 21% калорий за счет белков, 71% калорий за счет углеводов, 2,6 ккал/г; специальные корма Gordon’s Specialty Stock Feeds, Яндерра, Новый Южный Уэльс, Австралия), либо HFD (23% калорий из жира, 19,4% калорий из белка, 4,7% калорий из сырой клетчатки, 4.7% калорий из кислотно-детергентной клетчатки и 20 МДж/кг; Specialty Feeds, Глен Форрест, Вашингтон, Австралия).

Поколение мышей Npffr2 ^{− /−} подробно описано на дополнительном рисунке 1. Зонд кДНК Npffr2 . Были выделены и картированы положительно гибридизующиеся клоны. Три фрагмента BamHI, покрывающие экзоны 2 и 3, а также окружающие области, субклонировали и использовали для создания нацеливающей конструкции.Кассету, содержащую ген устойчивости к неомицину ( Neo ), фланкированный с одной стороны сайтом распознавания Cre-рекомбиназой (loxP) длиной 34 п.н., помещали ниже экзона 2 гена Npffr2 . Вторую последовательность loxP встраивали выше экзона 2 путем клонирования двух комплементарных 46-мерных олигонуклеотидов в уникальный сайт NheI на 2,5 т.п.н. выше экзона 2. Экзон 2 содержит начало трансляции гена Npffr2 , удаление которого приводит к действию Cre-рекомбиназы. в нефункциональном гене Npffr2 .Линеаризованный нацеливающий вектор трансфицировали в линию клеток ES Bruce4 (фон C57BL/6-Thy1.1, Ozgene) и положительные клоны подвергали скринингу с помощью Саузерн-блоттинга. Два положительных клона вводили в бластоцисты C57BL/6, и химерных мышей скрещивали с мышами C57BL/6 для получения гетерозиготных, а затем и гомозиготных мышей с условной NPFFR2. Скрещивание гомозиготных мышей, кондиционированных NPFFR2, с ооцит-специфической Cre-трансгенной линией использовали для получения мышей NPFFR2 KO с делецией зародышевой линии.

для генерации индуцируемой и условной модели мыши NPFFR2 KO, где NPFFR2 специально удаляется из NPAFR2 на индукции Tamoxifen, NPFFR2 ^{Mox / Lox} MICE были скрещены с NPY ^{Creert2 / +} Mice ³⁸ на фоне C57BL/6 для генерации Npy ^CreERT2/+ ; Npffr2 ^lox/+ мышей и колонию размножения поддерживали скрещиванием Npy ^CreERT2/+ ; Npffr2 ^lox/+ и Npffr2 ^lox/lox мыши.Генотипирование проводили методом ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из кончиков хвостов. Индукцию делеции NPFFR2 из нейронов NPY индуцировали путем кормления Npy ^CreERT2/+ ; Npffr2 ^lox/+ мыши с тамоксифеновой диетой (500 мг тамоксифена/кг корма, Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia) (далее именуемые «условно нокаутирующими») в возрасте 6 недель в течение 3 недель после которых мышей переводили на обычную диету за 2 недели до фенотипирования. Npy ^CreERT2/+ ; Npffr2 ^lox/lox мыши, не получавшие диету с тамоксифеном и Npy ^CreERT2/+ ; Npffr2 ^lox/+ , получавшие тамоксифен, использовали в качестве контроля. Для этого исследования были использованы самцы мышей из-за возможного сильного воздействия тамоксифена — селективного модулятора рецептора эстрогена — на самок мышей.

Для подхода к аффинной очистке рибосомной трансляции (TRAP) мыши ROSA26CAGGFP-L10a были получены из лаборатории Jax (B6;129S4- Gt(ROSA)26Sor ^{tm9(EGFP/Rpl10a)Amc J 9026/ на нашу линию NPYcre, полученную из лаборатории Jax (Tg(Npy-cre)Rh36Gsat) 40,58 .}

Мониторинг мышей и анализ тканей

Массу тела мышей отслеживали еженедельно. WT и Npffr2 ^{− /−} мышей обоего пола в возрасте 12 недель были исследованы на содержание жира и мышечной массы всего тела с помощью DEXA (мышиный денситометр Lunar PIXImus2; GE Healthcare, Waukesha, WI, USA). под легкой изофлурановой анестезией. Голова и хвост были исключены из анализа DEXA. Спонтанное ежедневное потребление пищи исследовали в возрасте 15 недель, когда мышей переводили из группового содержания на мягкой подстилке в индивидуальные клетки с подстилкой из бумажных полотенец и оставляли для акклиматизации на две ночи.Базальное суточное потребление пищи определяли как среднее значение повторных измерений, полученных в течение 2 дней подряд. В возрасте 18 недель у животных исследовали энергетический обмен с помощью непрямой калориметрии, как описано ниже. Мышей забивали в возрасте 20 недель между 12:00 и 15:00 ч путем смещения шейных позвонков с последующим обезглавливанием. Депо белой жировой ткани (паховые, эпидидимальные, мезентериальные и забрюшинные) удаляли и взвешивали, как опубликовано ранее ⁵⁹ . Мозг и BAT удаляли и замораживали для дальнейшего анализа с помощью количественной ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга, соответственно, как описано ниже.Бедра вырезали, фиксировали в течение ночи в 4% параформальдегиде (PFA) в фосфатно-солевом буфере (PBS) при 4°C, а затем хранили в 70% этаноле при 4°C перед обработкой, как подробно описано ниже.

У условно нокаутированных мышей и контрольных мышей еженедельно отслеживали массу тела и исследовали спонтанное потребление пищи, энергетический обмен с помощью непрямой калориметрии с последующим определением состава тела по составу тела с помощью DEXA и ожирения путем рассечения тканей в возрасте 14, 15 и 16 недель, соответственно, следуя процедурам, описанным выше или подробно описанным ниже.Бедренные кости собирали при сборе тканей и обрабатывали, как описано выше.

Исследование кормления с высоким содержанием жиров

Отдельный набор из Npffr2 ^{− /−} и мышей WT в возрасте 8 недель получали HFD (23 % калорий из жира, 19,4 % калорий из белка). , 4,7 % калорий из сырой клетчатки, 4,7 % калорий из кислотно-детергентной клетчатки и 20 МДж/кг; Specialty Feeds, Глен Форрест, Вашингтон, Австралия) в течение 8 недель. Массу тела контролировали в течение всего периода кормления HFD.Через 6 недель на HFD мышей исследовали на предмет состава тела с помощью DEXA-сканирования, как описано выше. После 7 недель HFD оценивали скорость метаболизма, соотношение RER и физическую активность, как описано ниже, с одновременным измерением потребления пищи. Анализ тканей проводили в конце 8 недель кормления HFD, как описано выше.

Подгруппу мышей с нокаутом и контрольных мышей в возрасте 12,5 недель кормили HFD в течение 5 недель с еженедельным мониторингом массы тела. Спонтанное потребление пищи, энергетический обмен с помощью непрямой калориметрии с последующим анализом состава тела с помощью DEXA и ожирение с помощью рассечения тканей проводили через 3, 4 и 5 недель после начала кормления HFD соответственно.

Непрямая калориметрия и измерение физической активности

Скорость метаболизма измеряли с помощью непрямой калориметрии с использованием восьмикамерного калориметра открытого цикла (серия Oxymax; Columbus Instruments, Колумбус, Огайо, США), как описано ранее ⁵⁹ . Вкратце, мышей помещали индивидуально в специально сконструированные клетки из плексигласа (20,1 ×10,1 ×12,7 см). Температуру поддерживали на уровне 22 °C с потоком воздуха 0,6 л/мин. Мышей содержали отдельно не менее чем за 3 дня до их перевода в клетки из плексигласа и акклиматизировали в клетках в течение 24 часов до начала регистрации.После этого за мышами наблюдали в системе в течение 24 часов. Потребление кислорода ( V O2) и производство углекислого газа ( V CO2) измеряли каждые 27 мин. Соотношение RER рассчитывали как частное V CO2/ V O2, при этом 100% окисление углеводов дает значение 1, а 100% окисление жиров дает значение 0,7 ^60,61 . Расход энергии (выработанное ккал тепла) рассчитывали как теплотворную способность (CV) ×  V O2, где CV составляет 3,815 + 1,232 × RER ⁶² .Расход энергии нормализовали по массе ВЖТ (безжировая масса тела + (0,2) × жировая масса) ²⁶ . Данные за 24-часовой период мониторинга были усреднены для 1-часовых интервалов по расходу энергии и RER. Амбулаторную активность отдельно содержащихся мышей оценивали в метаболических камерах с использованием сенсорной системы OPTO-M3 (Columbus Instruments, Колумбус, Огайо, США), при этом амбулаторные подсчеты представляли собой запись последовательных соседних перерывов фотолуча. Совокупный амбулаторный счет в направлениях X и Y регистрировался каждую минуту и ​​суммировался с интервалом в 1 час.

Определение температуры тела и BAT

Подмножество самцов и самок мышей WT и Npffr2 ^{− /−} изучали температуру тела и BAT с помощью неинвазивной высокочувствительной инфракрасной визуализации ^{6 6 ,64} . На протяжении всего исследования мышей содержали группами по две-три мыши в клетке, если не указано иное, и кормили либо кормом, либо HFD. За два дня до инфракрасной визуализации мышей брили в межлопаточной и поясничной областях спины под легкой анестезией изофлураном, чтобы обнажить кожу этих областей для измерения температуры.Эксперименты с инфракрасной визуализацией проводились в следующие 2 дня подряд, и показания двух измерений усреднялись. Вкратце, высокочувствительная инфракрасная камера (ThermoCAM T640, FLIR, Danderyd, Швеция, чувствительность = 0,04 °C), закрепленная на штативе, была помещена на 90 см над свободно движущимися мышами для регистрации температуры поверхности мышей в диапазоне 30–60°C. видео. Из видео были извлечены термокадры, на которых тело мыши было естественным образом вытянуто с обеими выбритыми участками кожи, расположенными вертикально к объективам камеры.Самые горячие пиксели поясничной области спины и межлопаточной области из каждого выделенного кадра были получены одновременно и использованы как индикаторы температуры тела и БЖТ соответственно.

Инъекции лептина и иммуногистохимические исследования pSTAT3

WT и Npffr2 ^{− /−} мышей в возрасте 15 недель исследовали на активацию pSTAT3 в ответ на лептин. Лептин (Peprotech #450-31) вводили либо внутрибрюшинно, либо внутрибрюшинно. (2  мкг/г массы тела) или i.резюме. (1,25 мкг, 1 мкл) инъекции мышам, которым вводили физиологический раствор, в качестве контроля. i.c.v. инъекции следовали процедурам, описанным ранее ⁶⁵ . Тридцать минут спустя под анестезией кетамином/ксилазином мышей подвергали перфузии сердца физиологическим раствором и 4% формальдегидом в PBS. Мозг удаляли, затем фиксировали при 4°C в течение ночи в 4% формальдегиде в PBS и обезвоживали в 30% глюкозе при 4°C до погружения. Впоследствии мозг хранили при - 80 °C до тех пор, пока он не был подвергнут коронарному разрезу на криостате толщиной 40 мкм.Свободно плавающие срезы предварительно обрабатывали лимонным буфером (рН 6,0) при 80°С в течение 30 мин, 3% H ₂ O ₂ в 50% этаноле в течение 15 мин и блокировали 5% нормальной козьей сывороткой в ​​PBS/0,2. % Triton X в течение 60 мин при комнатной температуре. Антитело против pSTAT3 (Cell Signaling #9145, 1:500) добавляли в разбавитель для антител, содержащий 2,5% нормальной козьей сыворотки и 0,1% альбумина бычьей сыворотки (BSA) в PBS/0,2% Triton X, и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре при осторожном покачивании. Срезы промывали, инкубировали со вторичным антителом козы против кроличьего IgG-биотина (1:250, Sigma #B8895) в разбавителе антител в течение 1 часа.Затем срезы инкубировали с ExtrAVidin-пероксидазой (1:250, Sigma #E2886) в разбавителе антител в течение 1 ч, и сигнал проявляли жидким субстратом DAB (Dako #K3468). Срезы помещали на предметные стекла Superfrost® (Menzel-Glaser, Брауншвейг, Германия), закрывали покровным стеклом и фотографировали с помощью микроскопа DM 6000 Power Mosaic (Leica, Германия). Для количественного определения количества клеток у каждой мыши ( n  = 3–4) были выбраны от трех до четырех срезов между уровнем брегмы - 1,58 мм и - 1,94 мм. Все pSTAT3-иммунопозитивные клетки с четким профилем на Arc подсчитывали, а затем усредняли для каждой мыши как количество на срез.

Отдельная группа мышей WT и Npffr2 ^{− /−} получала HFD в течение 6 недель, а затем внутрибрюшинно. инъекция лептина (2 мкг/г массы тела) или физиологического раствора (10 мкл/г массы тела). Через 30 минут мышей умерщвляли для иммуногистохимического исследования экспрессии pSTAT3 в соответствии с протоколом, описанным выше.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг проводили на образцах BAT в соответствии с процедурами, описанными ранее ⁵⁹ , для определения уровней белка UCP-1 и PGC-1α.Вкратце, образцы BAT ресуспендировали в буфере для радиоиммунопреципитации (PBS, pH 7,5; 1% nonident NP-40; 0,5% дезоксихолата натрия и 0,1% SDS) с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз (10  мкг/мл фенилметилсульфонилфторида, 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпептина, 1 ммоль/л Na ₃ VO ₄ и 10 ммоль/л NaF) и солюбилизировали в течение 2 часов при 4 °C. Равные количества лизата ткани (20  мкг белка) разделяли с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и подвергали иммуноблотингу с соответствующими антителами против PGC-1α (Millipore AB3242, 1:1000), UCP-1 (Alpha Diagnostics International, UCP11-A, 1: 1000) и GAPDH (Cell Signaling #3683, 1:1000).Иммуномеченые полосы визуализировали с помощью системы визуализации Fusion Fx7 (Vilber Lourmat, Франция) и количественно оценивали с помощью денситометрии с использованием Fiji: платформы с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений. Изображение маркера молекулярного размера накладывали на изображение иммуномеченых полос того же блота для идентификации конкретных полос на пятне. Необрезанное изображение геля репрезентативных полос и такое же необрезанное изображение геля, наложенное на маркер молекулярного размера, показаны на дополнительной фигуре 9. Уровни белка PGC-1α или UCP-1 были нормализованы к GAPDH и проанализированы на мг белка и на депо BAT. как описано ранее ⁶⁶ , и представлено в процентах от контрольной группы.

Экстракция РНК и количественная ПЦР в реальном времени

Мы измерили уровни экспрессии мРНК Npvf и Prlh в гипоталамической области головного мозга и Npff в области ствола головного мозга, следуя процедурам, описанным ранее ⁵⁹ . Таким образом, общую РНК из области гипоталамуса и области ствола головного мозга экстрагировали с использованием реагента TRIzol ^® (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в соответствии с протоколом производителя. Качество и концентрацию РНК определяли путем измерения оптической плотности при 260 и 280 нм с помощью спектрофотометра (NanoDrop 1000, NanoDrop Technologies, LLC, США).Для обработки ДНКазой (RQ1 RNase-Free DNase, Promega, Мэдисон, Висконсин, США) было взято два микрограмма тотальной РНК для удаления загрязнения геномной ДНК. Затем синтезировали кДНК с олиго(dT) ₂₀ и случайными гексамерами с использованием системы синтеза первой цепи Superscript III для ПЦР с обратной транскрипцией (Invitrogen, Mount Waverley, VIC, Australia). Затем проводили количественную ПЦР в реальном времени на приборе ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems Inc, Фостер-Сити, Калифорния, США) с использованием мастер-микса TaqMan Universal PCR (Applied Biosystems Inc., Фостер-Сити, Калифорния, США), следуя инструкциям производителя. Зонды и праймеры для целевого гена, NPVF (MM00452052_M1), NPFF (MM00450676_G1), PRLH (MM01286067_M1) и эталонный ген, ACTB (MM00607939_S1), были выбраны из реагентов анализа анализа экспрессии генов Taqman (MM00607939_S1). Applied Biosystems, Inc., Фостер-Сити, Калифорния, США). Флуоресцентные сигналы, генерируемые во время ПЦР-амплификации, отслеживали и анализировали с помощью программного обеспечения ABI Prism 7900 HT SDS (Applied Biosystems, Inc., Фостер-Сити, Калифорния, США). Чтобы определить эффективность каждого анализа экспрессии гена TaqMan, стандартные кривые были построены путем серийного разведения кДНК, а количественные оценки уровней целевого и эталонного генов были получены путем измерения пороговых чисел цикла (Ct). Относительную экспрессию мРНК-мишени рассчитывали по значениям Ct гена-мишени и значению Ct эталонного гена Actb с использованием метода стандартной кривой (Sequence Detection Systems Chemistry Guide, Applied Biosystems, Inc).Для измерения уровня экспрессии Npffr2 и Kiss1r использовали LightCycle (система ПЦР в реальном времени LightCycler 480; Roche Applied Science, Манхельм, Германия). Праймеры 5′-AAGCAGCATGTGCAAGATCA-3′ и 5′-TGACAGTGAGCTTTGGCTTA-3′ использовали для Npffr2 , 5′-TGCTGGCTCTATATCTGCTG-3′ и 5′-CTTGAAGCACCAGGAACAGC-3′ использовали для Kiss1r . Условия ПЦР, использованные при измерении этих генов, были следующими: ⁶⁷ : 94°С в течение 30 с, 62°С в течение 30 с, 72°С в течение 20°С в течение 40 циклов.Экспрессию гена нормализовали до экспрессии гена домашнего хозяйства Actb .

Гибридизация in situ

Коронарные срезы головного мозга (25 мкм) были вырезаны в криостате и помещены в оттаивающее стекло на предметные стекла Superfrost ^® (Menzel-Glaser, Брауншвейг, Германия). Совпадающие срезы из одного коронарного уровня мозга анализировали вместе с использованием олигонуклеотидов ДНК, комплементарных мышиному Npy (5′-GAGGGTCAGTCCACACAGCCCCATTCGCTTGTTACCTAGCAT-3′), мышиному проопиомеланокортину ( Pomc ) (5′-TGGCTGCTCTCCAGGCACCAGCTCCACACATCTATGGAGG-3′), thyrotroppin-рилизинг-гормон ( Trh ) (5′-AACCTTACTCCTCCAGAGGTTCCCT GACCCAGGCTTCCAGTTGTG-3 ‘), мышь TH ( Th ) (5′-CTCTAAGGAGCGCCGGATGGTGTGAGGACTGTCCAGTACATCA-3′, мышь Npff (5′-GAGACTGAGGAAGGCACAGGCAAGCAAGGAGCCATGAACCACAGG-3 ‘) и мышь Prlh (5′-GCTGTGAGAGAACTTGGCACTTCCATCCAGTGGGAAGCAGCTTAG-3′).Олигонуклеотиды метили [α- ³⁵ S] тио-дАТФ (PerkinElmer, Бостон, Массачусетс, США) с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (Roche, Мангейм, Германия) в соответствии с инструкциями производителя и очищали через колонку G25. Свежие срезы мозга фиксировали в 4% PFA, дважды промывали в PBS, предварительно обрабатывали уксусным ангидридом (0,25% об/об), дважды промывали в PBS, делипидировали в хлороформе, обезвоживали в этанолах, сушили на воздухе и гибридизовали с радиоактивно меченым зондом (2,5– 5,0 × 10 ⁵ в.вечера. на срез) в течение ночи во влажной камере при 42 °C. Затем предметные стекла трижды промывали в 5xSSC с 0,5 мМ DTT (1,4-дитиотреитол, VWR International #APLA29480005), дважды в 2 ×SSC/формамиде (50% об./об.) с 50 мМ DTT при 43°C, охлаждают до комнатной температуры, промывают в 1 × SSC, dH ₂ O и 70% этаноле и сушат на воздухе. Затем сигналы гибридизации на срезах визуализировали путем воздействия на пленку BioMax MR (Kodak, Rochester, NY, USA) и получали оцифрованные изображения со сканированных авторадиограмм.Для структурных деталей срезы головного мозга были погружены в фотоэмульсию и поверхностно окрашены гемотоксилином, с помощью которого интересующие области визуализировались и записывались в цифровые изображения, полученные с помощью светлопольного микроскопа (микроскоп DM 6000 Power Mosaic, Leica, Германия). Количественную оценку уровней экспрессии мРНК соответствующих генов проводили с помощью денситометрии для представляющих интерес областей мозга, выделенных с определенными размерами в соответствующих секциях на микрофотографиях с использованием программного обеспечения Fiji для Mac OS.

Мы использовали дуплексный хромогенный анализ RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Inc.) — новый метод ISH для визуализации множественных клеточных мРНК-мишеней в свежезамороженных тканях ⁶⁸ — для обнаружения совместной локализации Npffr2 и Npy в Arc , Npffr2 и Pomc в дуге, Lepr и Npff в стволе головного мозга. Коронарные срезы головного мозга (25 мкм) вырезали в криостате и оттаивали на предметных стеклах Superfrost ^® (Menzel-Glaser, Брауншвейг, Германия) и дважды метили мРНК Npy (ACD #313321-C2) и Npffr2 (ACD № 410171), Pomc (ACD № 314081-C2) и Npffr2 или Lepr (ACD № 402731) и Npff (ACD № 402731) и Npff (ACD № 3000), используя RNAscope®.5 Набор для обнаружения дуплекса в соответствии с протоколом производителя (Advanced Cell Diagnostics, Inc.). Окрашивание срезов фотографировали с помощью микроскопа DM 6000 Power Mosaic (Leica, Германия).

Иммуногистохимия pCREB и колокализация с нейронами NPY

Чтобы исследовать сигнальный ответ нейронов NPY на активацию NPFFR2, мы исследовали влияние активации сигнального пути NPFFR2 с помощью NPFF на индуцированное форксолином фосфорилирование CREB — нижестоящего звена, отвечающего на индуцированное форсколином увеличение по уровню цАМФ — у мышей NPY-GFP ^46,47 .Мыши NPY-GFP в возрасте 15 недель получали i.c.v. инъекция одного из следующих четырех растворов в объеме 1 мкл: физиологический раствор, форсколин (Sigma # F6886, 2,5 мМ), NPFF (150 нМ) или форсколин (2,5 мМ)   + NPFF (150 нМ) под анестезией кетамином/ксилазином. NPFF был любезно предоставлен профессором Annette G Beck-Sickinger (Университет Лейпцига, Германия). Процедуры для i.c.v. впрыска были как описано ранее ⁶⁵ . Через тридцать минут после инъекции мышей умерщвляли перфузией сердца физиологическим раствором и 4% формальдегидом в PBS.Мозг удаляли, затем фиксировали при 4°C в течение ночи в 4% формальдегиде в PBS и обезвоживали в 30% глюкозе при 4°C до погружения. Впоследствии мозг хранили при - 80 °C до коронарного разреза на криостате толщиной 40  мкм. Свободно плавающие срезы блокировали в 5% нормальной козьей сыворотке в PBS/0,2% Triton X в течение 60 мин при комнатной температуре и инкубировали с антителом против pCREB (Cell Signaling #9198, 1:800) в разбавителе антител, содержащем 2,5% нормальной козьей сыворотки. и 0,1% BSA в PBS/0,2% Triton X в течение ночи при комнатной температуре при осторожном покачивании.Срезы промывали, инкубировали с ослиным антителом против кроличьего Cy3 (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. #711-165-152) в разбавителе антител в течение 2 часов. Затем срезы промывали, помещали на предметные стекла Superfrost® (Menzel-Glaser, Брауншвейг, Германия), накрывали покровным стеклом и фотографировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica DM 5500, Германия), оснащенного цветной камерой (DFC310 Fx). Для количественной оценки были выбраны от двух до трех срезов между уровнями Bregma - 1,70 мм и - 1,94 мм от каждой мыши ( n  = 5 и 4 для группы форсколин и форсколин+ NPFF соответственно).Нейроны NPY, меченные GFP, pCREB-ir-позитивные нейроны, меченные Cy3, и колокализирующие нейроны NPY/pCREB в аркуатном ядре подсчитывали с использованием программного обеспечения Fiji для macOS. Две стороны аркуатного ядра подсчитывали отдельно, а подсчеты на каждую сторону аркуатного ядра из одного и того же мозга усредняли и представляли.

Ретроградное отслеживание нейронов

Мышам WT стереотаксически вводили в одну сторону Arc 0,5 мкл красных ретроградных шариков (Lumaflour, Inc.). Через четырнадцать дней после инъекции мышей умерщвляли перфузией сердца физиологическим раствором и 4% формальдегидом в PBS.Мозг удаляли, затем фиксировали при 4°C в течение ночи в 4% формальдегиде в PBS и обезвоживали в 30% глюкозе при 4°C до погружения. Впоследствии мозг хранили при - 80 °C до коронарного разреза на криостате толщиной 40  мкм. Свободно плавающие срезы собирали и помещали на предметные стекла Superfrost® (Menzel-Glaser, Брауншвейг, Германия), закрывали покровным стеклом и исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM 5500. Мечение трассером просматривали под флуоресцентным фильтром с 540–552 нм, 565 нм и 580–620 нм для возбуждения, светоделителя и излучения соответственно.Сигнал трассера также был проверен на возможное пересечение с другим каналом. Для этого мы использовали набор фильтров зеленого канала с 460–500 нм, 505 нм и 512–542 нм для возбуждения, светоделителя и излучения соответственно. Срезы фотографировали с помощью цветной камеры (DFC310 Fx), установленной на микроскопе.

КПЦР с обратной транскриптазой TRAP

Эксперимент TRAP был проведен на основе ранее опубликованного протокола с некоторыми изменениями ^40,69 . Таким образом, дугу вырезали путем осторожного ручного вскрытия под инвертированным микроскопом, используя четвертый желудочек в качестве эталона в охлажденном буфере для вскрытия (1 × сбалансированный солевой раствор Хэнка, 2.5 мМ HEPES-KOH [pH 7,4], 35 мМ глюкозы и 4 мМ NaHCO ₃ ) с добавлением свежего 100 мкг/мл циклогексимида (CHX; Sigma). Ткань гомогенизировали с помощью ручного миксера (Argos Technologies) в 500 мкл лизирующего буфера (20 мМ HEPES-KOH [pH 7,4], 5 мМ MgCl ₂ , 150 мМ KCl, 0,5 мМ DTT) с добавлением свежего ингибитора протеазы. (1 таблетка/мл; Roche Mini Complete, без ЭДТА), 100 мкг/мкл CHX и 40 ЕД/мл РНКзина (Promega), а затем инкубировали при 4 °C в течение 5 минут. Гомогенаты центрифугировали в течение 10 мин при 2000 ×  г при 4 °C для удаления ядер осадка и клеточного дебриса, а затем 50 мкл рабочего раствора NP-40 (10% об/об; Biochemica) и DHPC (300 мМ; Avanti Полярные липиды) добавляли к супернатанту и осторожно перемешивали, переворачивая смесь 10 раз.После инкубации на льду в течение 5 мин лизат центрифугировали в течение 10 мин при 13000× г . 20% лизата оставляли на входе. Что касается этапа приготовления шариков с антителами, 50 мкл магнитных шариков с белком G Dynal (Invitrogen) трижды промывали 0,15 М KCl буфером (20 мМ HEPES KOH [pH 7,4], 5 мМ MgCl ₂ , 150 мМ KCl, 1% В шарики добавляли NP-40, 0,5 мМ DTT, 100 мкг/мл CHX) при комнатной температуре, а затем 10 мкл антител против GFP (2 мкг/мкл; Invitrogen A11122) и инкубировали с шариками, суспендированными в 0.Буфер 15 М KCl (275 мкл) на 1 ч при комнатной температуре с легким вращением из конца в конец. Затем гранулы, связанные с антителами, собирали с помощью магнитной стойки и перед использованием трижды промывали 0,15 M буфером KCl. Затем шарики смешивали с супернатантом клеточного лизата и смесь инкубировали при 4 °C с легким вращением из конца в конец в течение ночи. Затем шарики собирали на магнитной стойке, трижды промывали 0,35 мМ буфером KCl (20 мМ HEPES KOH [pH 7,4], 5 мМ MgCl ₂ , 350 мМ KCl, 1% NP-40, 0.5 мМ DTT, 100 мкг/мл CHX) при 4 °C и немедленно помещали в 350 мкл буфера для лизиса РНК (RLT), дополненного 10% 2-меркаптоэтанола, при комнатной температуре и инкубировали в течение 5 мин. Затем RLT-содержащую РНК очищали с помощью набора RNeasy microKit (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Стадия расщепления ДНКазой была включена в очистку. Количественный анализ и чистота РНК подтверждались спектрофотометрами NanoDrop. Сорок нанограммов РНК использовали для синтеза кДНК с использованием системы синтеза первой нити SuperScript III (Thermo Fisher Scientific).RT-qPCR с использованием праймеров для Npy , GFP и Npffr2 проводили в образцах до (ввод) и после иммунопреципитации не менее чем в трех повторностях из кДНК в разведении 1:5 из каждого образца с использованием LightCycler ^® (LightCycler® Система ПЦР в реальном времени 480, Roche Applied Science, Германия), SYBR Green I (Molecular Probes) и ДНК-полимераза Platinum Taq (Invitrogen). Праймеры 5′-AATCAGTGTCTCAGGGCTG-3′ и 5′-CTATCTCTGCTCGTGTGTTT-3′ использовали для анализа Npy , 5′-CGGATCTTGAAGTTCACCTT-3′ и 5′-GAGCGCACCATCTTCTTCA-3′ использовали для GFP, 5′-GTACGACCAGAGGCATACA-3 ‘ и 5′-AGCACCCTGTGCTGCTCA-3’ использовали для Actb .Праймеры, использованные для Npffr2 , были описаны для экстракции РНК и количественной ПЦР в реальном времени. Условия ПЦР, использованные во всех экспериментах TRAP RT-qPCR, были следующими: 94°С в течение 30 с, 62°С в течение 30 с, 72°С в течение 20 с для 40 циклов ⁶⁷ . Экспрессию гена нормализовали до экспрессии гена домашнего хозяйства Actb .

МКТ костей

После фиксации левые бедра были очищены от мышц и проанализированы с помощью МКТ со сканером Skyscan 1172 и соответствующим программным обеспечением для анализа (Skyscan, Aartselaar, Blegium), как описано ранее ⁷⁰ .Вкратце, анализы кортикального слоя кости были проведены в 229 срезах (1,0 мм), выбранных из 572 срезов (2,5 мм) проксимально от дистальной пластинки роста, в результате чего были рассчитаны следующие параметры: общая площадь ткани, площадь кости, площадь костного мозга, периостальный периметр. , толщина коры и полярный момент инерции (показатель силы). Анализы трабекулярной кости были проведены в виде 229 срезов (1,0 мм) и выбраны 114 срезов (0,5 мм) проксимально от дистальной пластинки роста, в результате чего были рассчитаны следующие параметры: общий объем ткани, объем кости, трабекулярное число, трабекулярная толщина и трабекулярное разделение.

Поведенческое тестирование

WT и Npffr2 ^{− /−} мышей в возрасте 17 недель тестировали в батарее поведенческих тестов с межтестовым интервалом не менее 48 ч: приподнятый крестообразный лабиринт ( EPM), открытое поле (OF), торможение предимпульса, тесты двигательных функций (например, тест с шестом и тест с ходьбой по лучу) и тест с отдергиванием хвоста в горячей воде ⁷¹ . Все тесты проводились в течение первых 5 часов световой фазы, чтобы свести к минимуму влияние циркадного ритма на работоспособность подопытных мышей.

Приподнятый крестообразный лабиринт : EPM оценивает естественный конфликт между склонностью мышей исследовать новую среду и избеганием ярко освещенных возвышенных и открытых мест. Серый крестообразный лабиринт имел форму «+», как описано ранее ⁷² . Мышей помещали в центр «+» (лицом к закрытой руке) и позволяли исследовать лабиринт в течение 5 минут. Время, проведенное в открытом и закрытом ответвлениях, и количество входов регистрировали с помощью программного обеспечения для отслеживания AnyMaze ^TM (Stoelting, Wood Dale, США) (проценты рассчитаны на основе общего числа входов в рукава/общее время без учета центрального времени).

Открытое поле : Тест OF измеряет локомоцию, исследование и тревожное поведение. Этот тест имитирует естественный конфликт у мышей между тенденцией исследовать новую среду и избегать открытого пространства. Подопытных мышей помещали на 30 минут в контролируемую инфракрасным фотолучем камеру для исследования активности ОВ (43,2×43,2 см — уровень освещенности: 20 люкс; MED Associates, Inc., Вермонт, США), которая была разделена на центральную и периферическую зоны. (Координаты программного обеспечения MED для центральной зоны: 3/3, 3/13, 13/3, 13/13; размер окна: 3; амбулаторный триггер: 2; задержка покоя: 1000 мс; разрешение: 100 мс).Показатели передвижения включали пройденное расстояние и время ходьбы; вертикальная активность принималась как мера разведки (т. е. выращивания).

Тест отдергивания хвоста с горячей водой : Болевую чувствительность (т.е. ноцицепцию) оценивали с помощью теста отдергивания хвоста с горячей водой. Мышей осторожно заворачивали в полотенце из мягкой ткани, а кончик хвоста помещали в ванну с теплой водой при температуре 52 °C и регистрировали задержку, в течение которой они дергали хвостом. Каждая проба состояла из трех попыток (интервал между пробами 3–4 мин).В перерывах между испытаниями мышей возвращали в их домашнюю клетку.

Статистический анализ

Все данные выражены в виде средних значений ± SEM. Энергозатраты, ОЭД и физическую активность за непрерывный 24-часовой период усредняли за весь 24-часовой период, а также за светлый и темной периоды. Различия между разными генотипами оценивали с помощью двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) или повторных измерений ANOVA в сочетании с апостериорным анализом достоверных значимых различий Тьюки, где это уместно.Статистический анализ был выполнен с помощью SPSS для Mac OS X, версия 16.0.1 (SPSS, Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Статистическая значимость была определена как p  < 0,05.

Олигонуклеотиды

Список олигонуклеотидов, использованных в этом исследовании, представлен в дополнительной таблице 3. CFR | Закон США

{‘Код США’: [{‘Название’: ’15’, ‘Раздел’: ‘1191’, ‘заголовок’: ‘Определения’, ‘cleanpath’: ‘/uscode/text/15/1191’}, { ‘Название’: ’15’, ‘Раздел’: ‘1192’, ‘заголовок’: ‘Запрещенные транзакции’, ‘cleanpath’: ‘/uscode/text/15/1192’}, {‘Название’: ’15’, ‘Раздел’: ‘1193’, ‘заголовок’: ‘Стандарты или правила воспламеняемости’, ‘cleanpath’: ‘/uscode/text/15/1193’}, {‘Название’: ’15’, ‘Раздел’: ‘1194 ‘, ‘headtext’: ‘ Администрирование и обеспечение соблюдения’, ‘cleanpath’: ‘/uscode/text/15/1194’}, {‘Title’: ’15’, ‘Section’: ‘1195’, ‘headtext’: ‘ Процедуры судебного запрета и осуждения», «cleanpath»: «/uscode/text/15/1195»}, {«Заголовок»: «15», «Раздел»: «1196», «headtext»: «Штрафы», «cleanpath» : ‘/uscode/text/15/1196’}, {‘Название’: ’15’, ‘Раздел’: ‘1197’, ‘headtext’: ‘Гарантии’, ‘cleanpath’: ‘/uscode/text/15/ 1197’}, {‘Заголовок’: ’15’, ‘Раздел’: ‘1198’, ‘заголовок’: ‘ Отправления из зарубежных стран; спрос на повторную доставку; иск о заранее оцененных убытках», «cleanpath»: «/uscode/text/15/1198»}, {«Заголовок»: «15», «Раздел»: «1199», «headtext»: «Глава в качестве дополнительного законодательства», ‘cleanpath’: ‘/uscode/text/15/1199’}, {‘Название’: ’15’, ‘Раздел’: ‘1200’, ‘headtext’: ‘Лица, исключенные из работы главы’, ‘cleanpath’: ‘/uscode/text/15/1200’}, {‘Название’: ’15’, ‘Раздел’: ‘1201’, ‘заголовок’: ‘ Исследование и расследование; исследования, разработки и обучение», «cleanpath»: «/uscode/text/15/1201»}, {«Название»: «15», «Раздел»: «1202», «headtext»: «Исключения», «cleanpath ‘: ‘/uscode/text/15/1202’}, {‘Заголовок’: ’15’, ‘Раздел’: ‘1203’, ‘headtext’: ‘Приоритет федеральных стандартов’, ‘cleanpath’: ‘/uscode/ text/15/1203’}, {‘Заголовок’: ’15’, ‘Раздел’: ‘1204’, ‘headtext’: ‘Вето Конгресса на правила воспламеняемости’, ‘cleanpath’: ‘/uscode/text/15/1204 ‘}], ‘Устав в целом’: [{‘Том’: ’67’, ‘Страница’: ‘111—115’, ‘заголовок’: ’67 Стат.111—115′, ‘cleanpath’: ‘https://www.law.cornell.edu/rio/citation/67_Stat._111—115’}, {‘Том’: ’81’, ‘Страница’: ‘ 568-74», «заголовок»: «81 Stat. 568-74», «cleanpath»: «https://www.law.cornell.edu/rio/citation/81_Stat._568-74»}, {«Том»: «81», «Страница»: «569» , ‘заголовок’: ’81 Stat. 569 ‘, ‘cleanpath’: ‘https://www.law.cornell.edu/rio/citation/81_Stat._569’}, {‘Том’: ’81’, ‘Страница’: ‘570’, ‘заголовок’ : ’81 Стат. 570 ‘, ‘cleanpath’: ‘https://www.law.cornell.edu/rio/citation/81_Stat._570’}], ‘Общественные законы’: [{‘Конгресс’: ‘105’, ‘Номер закона’ : ‘105-276’, ‘заголовок’: ‘Паб Л.105-276», «cleanpath»: «https://www.law.cornell.edu/rio/citation/Pub._L._105-105-276»}], «Президентские документы»: []}